壯藥扶芳藤提取物調控骨代謝的體外實驗研究*

史 明，張文捷，李 健，李同林，張 勇，羅 滿

廣西國際壯醫醫院/廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院/廣西壯瑤藥技術研究中心,廣西 南寧 530023

原發性I 型骨質疏松癥（primary osteoporosis，PMOP）屬于高轉換型骨質疏松，雌激素替代療法（estrogen replacement therapy，ERT）是目前臨床治療PMOP 的重要方法之一，其主要通過抑制破骨細胞活性而防治PMOP，臨床應用已久，療效可靠。壯藥扶芳藤Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz 含有類雌激素樣成分，這在一些研究中得到了證實。瞿發林等［1］、楊穎達［2］均從扶芳藤中提取到了黃酮苷類化合物，而黃酮類成分作為一種類雌激素成分，為防治PMOP 提供了一種新的可能。因此，本研究對扶芳藤提取物調控體外骨代謝的作用做了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇出生后3～5 天的SD 大鼠6只，廣西中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK 桂2019-0001。大鼠購進后飼以標準的大鼠合成飼料常規飼養，觀察1 周無異常后進行實驗。整個實驗過程中動物自由攝食飲水，室溫控制在20～25℃，相對濕度40%～60%。

1.2 試藥與試劑扶芳藤提取物（自行制備），采用文獻［3］中乙醇法提取純化制作扶芳藤乙醇提取物浸膏；胰蛋白酶（上海兆吉生物科技有限公司，批號：140615）；最低基本（Minimum Essential Medium，MEM）培養基（Gibco 公司，批號：21700075）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）培養基（Gibco 公司，批號：16010-159）；羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，HEPES）緩沖液（上海信帆生物，批號：XFSJ-0087）；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（Methyl thiazolyl tetrazoliun，MTT）細胞增殖試劑盒（北京富龍康泰，批號：FP-M-300）；抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resisatnt acid phosphatase，TRAP）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所，批號：P0332）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養方法 采用大鼠顱蓋骨機械法［4］體外分離培養獲得成骨細胞（osteoblast，OB）；采用新生大鼠長干骨機械分離法［5］獲得破骨細胞（osteoclast，OC）。

1.3.2 分組方法 采用隨機數字表法分為觀察組和對照組，觀察組培養液為10%（體積分數）FBS+αMEM 培養液+高濃度扶芳藤提取物，對照組不加扶芳藤提取物。

1.3.3 促進骨形成的實驗及檢測方法 將高濃度扶芳藤提取物（扶芳藤乙醇提取物浸膏含量為200 mg/kg）加入到 OB 細胞培養箱中（48 孔培養板，每孔加入80 μL）。采用骨鈣素免疫組化法和體外鈣化能力實驗進行0B 的鑒定，采用MTT 比色法檢測0B 增殖。利用對硝基苯磷酸二鈉基質動力學比色法（Para-nitrophenyl phosphate，pNPP）檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）含量及活性。

l.3.4 抑制骨吸收的實驗及檢測方法 將高濃度扶芳藤提取物加入到OC細胞培養箱中（48孔培養板，每孔加入80 μL）。根據試劑盒說明進行TRAP染色，鑒定OC并進行形態學觀察。采用顯微鏡觀察不同時間點骨片上吸收陷窩的變化，于培養第7 天對陷窩進行攝影，采用Mimics Medical 21.0 醫學圖像處理軟件分析吸收陷窩面積。采用原子分光光度計法測定OC 培養液上清液中鈣離子含量。

l.4 統計學方法數據采用PEMS 3.2 醫學統計軟件進行統計學處理，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OB 細胞周期及ALP 含量大鼠OB 在培養液中培養24、48、72 h后，觀察組與對照組相比，各時相點均無明顯差異（P＞0.05）。與對照組相比，觀察組在 24、48、72 h 3 個時相點均能夠提高 ALP 活性，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 骨吸收陷窩面積及鈣離子含量加入高濃度扶芳藤提取物后，鏡下見OC發生明顯空泡性變，細胞輪廓模糊不清，TRAP著色不均勻。體外OC培養7 天后，觀察組骨吸收陷窩面積明顯縮小，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。體外OC培養7天后，觀察組培養液上清液中鈣離子含量下降，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組OB細胞周期、ALP含量及活性比較（）

表1 兩組OB細胞周期、ALP含量及活性比較（）

組別觀察組對照組例數12 12 OB細胞周期（%）ALP含量（μ/L）24 h 59.35±6.04 56.78±4.29 1.2017 0.2423 72 h 52.76±5.65 54.95±6.42 0.8871 0.3846 t P 48 h 53.48±7.08 54.62±3.76 0.5056 0.6182 24 h 29.42±3.16 18.37±2.59 9.3686 0.0000 48 h 56.33±6.03 24.62±3.48 15.7777 0.0000 72 h 68.57±8.12 28.42±4.39 15.0675 0.0000

表2 兩組骨吸收陷窩面積及鈣離子含量比較（）

表2 兩組骨吸收陷窩面積及鈣離子含量比較（）

組別觀察組對照組例數12 12 t P骨吸收陷窩的面積（um2）0天569.42±75.45 628.36±86.59 1.7777 0.0893 7天106.49±25.15 2874.62±372.44 25.6883 0.0000鈣離子含量（mg/L）0天66.72±6.39 68.31±7.24 0.5704 0.5742 7天46.05±5.47 67.62±6.85 8.5239 0.0000

3 討論

扶 芳 藤 Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz為衛矛科衛矛屬植物［6］，屬于廣西道地藥材。扶芳藤入藥首載于《本草拾遺》：“扶芳藤，味苦，小溫，無毒，主一切血，一切氣，一切冷，去百病，久服延年，變白，不老，大主風血”，可用于治療風濕痹痛、腰肌勞損、吐血、血崩、創傷出血、月經不調、血瘀閉經、跌打骨折等，主要以莖葉入藥，全年可采，在廣西民間應用十分廣泛，屬于典型的壯藥。《中藥大辭典》記載：“補腎強筋，安胎，止血消瘀”“扶芳藤泡酒日服兩次，治風濕疼痛”“扶芳藤治腰肌勞損、關節酸痛”，傳統醫學用其治療腎虛腰痛、腰肌勞損、風濕痹痛、慢性腹瀉、咯血、血崩、月經不調、跌打骨折、創傷出血等。《中國壯藥資源名錄》中記載［7］，扶芳藤微苦，熱，通調龍路、火路，補氣、血虛，強筋骨，止血，用于嘞內（血虛）、噓內（氣虛）、核難（腰肌勞損）、發旺（風濕痹痛），林得叮相（跌打損傷）、奪扼（骨折）、叮相噢嘞（創傷出血）、鹿嘞（吐血）、約京亂（月經不調）、貧淋嘞（崩漏）、嘚聚綏（落枕）。

扶芳藤雖為壯藥，但是長期以來都是在中醫藥理論的指導下被廣泛研究。陳曦［8］研究發現，復方扶芳藤合劑能在一定程度上降低骨破壞進展，可有效減少骨小梁的斷裂，降低骨小梁間距。治療作用和劑量有一定的依賴關系，從而推論出復方扶芳藤合劑對去卵巢大鼠引起的大鼠骨代謝具有積極影響。

成骨細胞和破骨細胞表面均有雌激素受體，它們分別是骨形成和骨分解代謝中的主要功能細胞。本研究結果表明，高濃度扶芳藤提取物可以提高成骨細胞ALP 的活性。ALP 是成骨細胞分化成熟的標記酶，是成骨細胞分化早期的重要生物學標志，在礦化過程中起著重要作用，是骨轉換率的重要指標［9］。因此可以認為扶芳藤提取物對體外骨形成具有一定的促進作用。另一方面，高濃度扶芳藤提取物可引起體外破骨細胞形態學上的顯著變化及骨吸收陷窩的面積降低，并引起OC 培養液上清液鈣離子含量的下降，表明其對體外骨吸收有一定的抑制作用。此種表現與雌激素的作用特點相符。對扶芳藤的相關研究［10-12］表明，扶芳藤中存在一系列黃酮苷類成分，且含量較高，這類黃酮苷可被作為扶芳藤藥材定量控制的指標性成分。李恩［13］對含有植物雌激素和黃酮類的多種中藥進行了全方復方及拆方研究，發現含有黃酮類成分的中藥普遍具有促進成骨細胞增殖、分化作用。李晶等［14］研究證實，含有此類成分的淫羊藿總黃酮可增強去勢大鼠椎體的彈性，降低其脆性，具有抗骨質疏松的作用。葉丙霖等［15］通過文獻總結了補腎活血類中藥治療絕經期骨質疏松癥的作用機制，發現多種補腎活血中藥發揮抗骨質疏松的作用機理主要依賴于其含有的類雌激素化合物以及對成骨、破骨細胞的作用。因此，讓扶芳藤提取物能發揮雌激素替代療法的作用從而防治PMOP成為一種臨床可能。

綜上所述，扶芳藤提取物可調控體外培養的破骨細胞及成骨細胞骨代謝，但其分子生物學機制有待進一步深入研究。