蘇木乙酸乙酯提取液通過miRNA-129-5p/Beclin1信號對血管內皮細胞自噬的影響*

李鑫峰 袁星星 周亞濱 楊建飛 王 倩

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；4.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

動脈粥樣硬化（AS）是缺血性心血管疾病的主要病理基礎，主要表現為大中動脈內膜內的脂質堆積，促使管壁斑塊形成、壞死、彈性降低，最終引起管腔狹窄或者阻塞的一類血管炎性疾病［1-2］。既往研究認為AS主要與脂質代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應、血小板激活、血管平滑肌細胞激活及免疫功能異常等因素有關［3］。然而近年來越來越多的研究關注到內皮細胞損傷在早期AS中的作用，因此修復內皮細胞損傷對于防治AS具有重要的意義。細胞自噬是真核生物內廣泛存在的一種自穩機制，其主要通過清除生物體內功能異常的細胞器、被氧化的脂質及錯誤折疊的蛋白質等有害大分子物質以維持細胞的正常功能。內皮細胞自噬已被證實在AS發生初期起到了關鍵性的作用，自噬能夠增強內皮細胞抗氧化應激損傷的能力和抑制內皮細胞凋亡，進而減緩斑塊的形成［4］。課題組前期的研究結果發現蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）能夠通過抗炎、免疫調控、抑制脂質沉積和增加斑塊穩定性等方面發揮抑制AS的作用［5-8］。同時，筆者研究發現SAEE能夠促進細胞自噬進而抑制高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠證實動脈粥樣斑塊的形成和脂質蓄積。為進一步研究SAEE促進自噬的機制，本研究通過觀察SAEE對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）所誘導的內皮細胞損傷模型中自噬水平及miRNA-129-5p/Beclin1信號影響，以期進一步明確SAEE抑制AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）購自武漢佰仟度生物科技有限公司，該細胞株由美國典型培養物保藏中心引進。

1.2 藥物與試劑

ox-LDL購自北京索萊寶公司（貨號：H7980）；蘇木生藥購自貴州中醫藥大學第二附屬醫院，經乙醇浸泡等工序，合并后的濾水浴蒸干，制備乙醇提取干粉。經乙酸乙酯萃取后，所得溶液即為SAEE（純度98%）。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購于上海碧云天生物技術有限公司（貨號分別為C0009和A0208）；RPMI 1640、10%胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素混合液購于美國Gibco公司（貨號分別為A4192301，16140071和10378016）；兔抗Beclin1、LC3B和GAPDH單克隆抗體購于美國Abcam公司（貨號分別為ab210498，ab192890和ab8245）；逆轉錄試劑盒購于北京寶日醫生物技術有限公司（貨號RR047A）；RNA提取試劑盒和SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒購于美國Thermo Fisher公司（貨號分別為15596026和A25742）；雙熒光素酶報告質粒載體psi CHECK2購于美國Promega公司（批號1908319）；miRNA-129-5p mimics和miRNA-129-5p NC由上海吉瑪制藥技術有限公司合成（批號191019）。

1.3 分組及干預

HUVEC放入含10%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素混合液的DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中。HUVEC以2×105個細胞數種于100 mm培養皿中，分為空白組、模型組、SAEE組、模擬劑組及SAEE+模擬劑組，其中除空白組外，其余組參照文獻［9］中方法采用100 μg/mL ox-LDL對細胞進行誘導構建內皮細胞損傷模型。此外，模擬劑組及SAEE+模擬劑組分別參照試劑說明書要求，轉染100 nmoL miR-129-5p至細胞，SAEE組和SAEE+模擬劑組加入200 μg/mL SAEE進行干預。

1.4 指標檢測

1.4.1 MTT法檢測細胞活性 分別于培養12、24、48 h的各組細胞中加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h。棄培養基后加入150 μL DMSO溶液，在酶標儀上于570 nm波長處測定各孔吸光度（A），并計算細胞活性。

1.4.2 細胞形態觀察 于48 h收集各組細胞，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態及密度的變化。

1.4.3 熒光素酶報告基因實驗檢測miRNA-129-5p和Beclin1的結合活性 基于TargetScan數據庫預測Beclin1與miR-129-5p的結合位點，將Beclin1中miR-129-5p結合位點的3′UTR的基因片段，插入psi CHECK2載體后構建Beclin1 3′UTR野生型質粒，同時利用基因位點突變構建Beclin1 3′UTR突變質粒后，采用RT-PCR驗證。用WT質粒/MUT質粒和miR-129-5p mimics NC/miR-129-5p mimics分別對HUVEC細胞轉染，48 h后提取細胞加入細胞裂解液，10 000×g離心5 min，取上清。參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明分別檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性，通過兩者比值計算其相對熒光素酶活性。

1.4.4 RT-PCR法檢測miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA的表達 于48 h收集各組HUVEC細胞，分別采用相應的試劑盒提取細胞中總RNA或miRNA，核酸檢測儀測定濃度，并在每個樣本中取1 μg的RNA，通過逆轉錄進行cDNA的合成。在PCR條件下分別為85 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，40個周期60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，以U6作為參照測定miR-129-5p表達水平，以GAPDH作為內參測定 Beclin1 mRNA 水平，用 2-ΔΔCt法計算樣品中相應基因的表達水平的變化。各實驗組均設置3個平行復孔，重復3次。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR中的PCR反應引物

1.4.5 透射電鏡觀察細胞超微結構及自噬水平 于48 h收集各組細胞，PBS清洗，3%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，梯度酒精、丙酮脫水，包埋，50 nm超薄切片。置于銅網以3%檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，透射電鏡下觀察細胞超微結構及自噬水平。

1.4.6 Western blotting檢測Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達 于48 h收集各組HUVEC細胞，經PBS洗滌后加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清，以BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后電轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋后的一抗：Beclin1（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。加入稀釋后的二抗，室溫下孵育1 h。待ECL試劑盒顯色后，以凝膠成像系統進行拍照。采用Image J對目的條帶和GAPDH條帶灰度值的比值進行處理，作為目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件。數據以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間比較采用最小顯著性差異法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組HUVEC細胞增殖情況比較

見表2。MTT檢測結果顯示，各組細胞12 h時OD值無明顯差異。培養24、48 h后，模型組OD值明顯低于空白組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，SAEE能夠顯著促進HUVEC細胞的增殖，而miRNA-129-5p模擬劑顯著抑制HUVEC細胞的增殖，差異均具有統計學意義（P＜0.05），而SAEE+模擬劑組與模型組比較，OD值無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組細胞增殖情況比較（±s）

表2 各組細胞增殖情況比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組12 h 0.25±0.05 0.22±0.04*0.23±0.02△0.16±0.05△0.18±0.04 24 h 0.43±0.08 0.38±0.06*0.39±0.08△0.25±0.09△0.26±0.04 48 h 0.67±0.12 0.46±0.11*0.71±0.09△0.43±0.07△0.47±0.08

2.2 各組HUVEC細胞形態的比較

如圖1所示，空白組HUVEC細胞發育良好，呈橢圓或梭形，邊緣光滑，排列整齊。模型組細胞數量相比空白組明顯減少，可見大量細胞碎片，細胞呈星形或長梭形，且排列紊亂。SAEE組細胞形態、密度與排列相比模型組顯著改善，模擬劑組細胞損傷較模型組加重，SAEE+模擬劑組細胞形態及排列與模型組比較無明顯改善。

圖1 各組HUVEC細胞形態及密度的變化（100倍）

2.3各組miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達的比較

雙熒光素報告基因實驗結果顯示，共轉染Beclin1-WT報告載體后，miRNA-129-5p mimic組的熒光素酶活性比miRNA-129-5p NC組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；而共轉染Beclin1-MUT報告載體后，miRNA-129-5p mimic組熒光素酶活性與miRNA-129-5p NC組差異無統計學意義（P＞0.05），這表明Beclin1與miRNA-129-5p存在特異性結合位點。見表3。與空白組相比，模型組miR-129-5p的表達水平無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，SAEE組miR-129-5p的表達水平顯著下降，模擬劑組miR-129-5p的表達水平顯著上升，差異均具有統計學意義（P＜0.05），SAEE+模擬劑組miR-129-5p的表達水平與模型組無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。而各組Beclin1 mRNA的表達無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組miRNA-129-5p和Beclin1結合活性比較（±s）

表3 各組miRNA-129-5p和Beclin1結合活性比較（±s）

注：與miRNA-129-5p NC比較，*P＜0.05。

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表4 各組細胞中miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達的比較（±s）

表4 各組細胞中miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達的比較（±s）

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2.4 各組HUVEC細胞超微結構及自噬水平的比較

透射電鏡結果顯示，空白組HUVEC細胞形態規整，細胞核大，可見少量自噬體和自噬溶酶體。模型組出現少量空泡，胞質變少，細胞核萎縮，可見自噬體數量增加和極少量自噬溶酶體。與模型組相比，SAEE組細胞形態明顯改善，同時自噬體和自噬溶酶體數量明顯增加，而模擬劑組細胞內空泡增多，胞質、細胞核萎縮情況加重，自噬體和自噬溶酶體數量明顯減少。此外，SAEE+模擬劑組與模型組比較，細胞形態、自噬體和自噬溶酶體數量無明顯變化。見圖2。

圖2 各組HUVEC細胞超微結構及自噬水平的比較（5 000倍，3%檸檬酸鉛+醋酸染色）

2.5 各組自噬相關蛋白表達的比較

見表5，圖3。與空白組相比，模型組細胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，SAEE組細胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著增加，模擬劑組中細胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。而SAEE+模擬劑組與模型組比較，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表5 各組細胞中miR-129-5p/Beclin1通路中相關蛋白表達的比較（±s）

表5 各組細胞中miR-129-5p/Beclin1通路中相關蛋白表達的比較（±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組Beclin1/GAPDH 0.82±0.11 0.85±0.09 1.24±0.12△0.59±0.05△0.79±0.15 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.45±0.07 0.52±0.05 0.71±0.13△0.34±0.02△0.56±0.08

圖3 各組細胞中自噬相關蛋白表達

3 討論

內皮細胞損傷已被證實參與AS啟動及進展的全過程，其可通過白細胞-內皮細胞黏附，繼而造成動脈血管攣縮、血小板凝聚、氧化應激等病理變化［10］。動脈血管受到外界刺激后，可導致內皮細胞功能障礙，異常分泌ICAM-1和VCAM-1等黏附因子，造成游離單核細胞黏附于內皮細胞表面，逐漸聚集形成AS斑塊。此外，大量凋亡的內皮細胞導致細胞數量急劇下降，造成內皮通透性發生改變并導致血管內膜損傷，而促進內皮細胞增殖可顯著抑制AS斑塊的形成［11-13］。

自噬作為細胞基礎代謝過程，對基因的調控具有重要意義。研究發現內皮細胞自噬對AS具有保護作用［14］。當自噬功能受損，炎性反應被激活，可加速AS進展［15］。自噬作為一種自我防御及保護機制，能夠有效清除受損細胞，降低內皮細胞凋亡及壞死［16］。此外，自噬能夠增強內皮細胞抗氧化應激能力，抑制內皮細胞凋亡，延緩AS斑塊形成。在自噬過程中，LC3前體經過處理變成可溶性LC3Ⅰ，再經過泛素樣加工修飾為LC3Ⅱ，LC3Ⅱ在自噬泡形成和轉運過程中，廣泛存在于自噬體胞膜內，研究表明LC3Ⅱ的表達與自噬泡數量呈正比，可將LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值作為觀察細胞自噬強度的可靠指標［17］。

MiRNA在AS的進程中意義重大。作為內源表達非編碼小分子RNA，其表達的改變會影響內皮細胞功能［18］。此外，內皮細胞的增殖、凋亡和遷移同樣受到miRNA調控［19］。在諸多miRNA表達中，miR-129-5p與內皮細胞自噬關系密切，miR-129-5p過表達抑制細胞輻射誘導自噬［20］。本研究通過TargetScan網站預測發現Beclin1是miR-129-5p的潛在靶基因。Beclin1是自噬啟動基因，能夠參與誘導、生成及成熟全過程，具有直接或間接連接調控基因的作用，對內皮細胞自噬及凋亡的意義重大［21-22］。Beclin 1參與觸發自噬體形成，與自噬表達程度呈正相關，因此成為衡量細胞自噬的常用指標之一［23］。研究發現miR-129-5p的上調是通過抑制Beclin1的蛋白翻譯、抑制內皮細胞自噬、延緩AS的進展而實現的［24］。

本研究通過觀察miR-129-5p與內皮細胞增殖、自噬的關系，探討其抑制AS的作用機制。研究通過ox-LDL誘導構建內皮細胞損傷模型并MTT法檢測細胞增殖發現12 h時，內皮細胞活性無顯著性差異，隨著時間的延長，SAEE能夠顯著促進細胞的增殖。RT-PCR結果發現，與模型組相比，SAEE組細胞中miR-129-5p的表達水平顯著下降，而各組Beclin1 mRNA水平無明顯變化，但是Beclin1蛋白的表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著增加，說明miR-129-5p是通過調控Beclin1轉錄后的翻譯水平，達到促進細胞自噬的作用。

綜上所述，SAEE可通過抑制miRNA-129-5p的表達促進Beclin1基因轉錄后翻譯水平，進而促進內皮細胞自噬，發揮抗AS的作用。