大鼠爪印印跡分析用于骨關節炎疼痛模型評估

李學艷，張 春，陳 默，顧成永

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種慢性關節退行性病變，關節疼痛是其主要臨床癥狀，嚴重影響了患者的生活質量[1]。 目前，關于OA 疼痛的研究越來越多。 然而，人體試驗在人類價值和科學價值之間存在一定的觀念沖突，所以利用動物模型實現科學研究成為了必不可少的部分[2]。 但是，在疼痛研究中，客觀準確的評估動物的疼痛學行為一直是一個難題。 采用von Frey 絲測定機械疼痛閾值被認為是經典的疼痛評估方法，但它極易受到操作者主觀因素干擾，測量值不穩定[3]。 近年來CatWalk 步態分析以其便捷、實時、客觀的優勢進入疼痛評估的行列[4]，但其價格昂貴，并非多數實驗室配備。 所以尋找一個較為簡便且經濟、客觀的實驗性疼痛衡量標準極為重要。

分析動物爪印印跡是一個簡易、經濟成本較低且主觀因素較少的測痛方法。 自上世紀80 年代以來，有學者提出，測量并分析動物爪印印跡可以有效評估坐骨神經及跟腱功能，間接反映功能受損程度[5-6]。 OA 模型是目前研究OA 疼痛的常見模型，不同于功能性受損。 故本研究應用OA 模型大鼠爪印印跡，測量并分析足印長度(print length，PL)、足趾擴展度(toe spreading length，TS)及中間足趾距離(inter toe distance，IT)，將其與經典的 von Frey 機械痛閾相比較，評估爪印印跡在OA 模型疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 選取4~6 w 健康雄性SD 大鼠30 只，體重170~220 g。 本研究經由南京醫科大學附屬蘇州醫院實驗動物委員會批準。 動物房溫度恒定為25 ℃，通風良好，且光照與黑暗12 h 周期交替。 給予腹腔注射10 %水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠， 將其固定于手術臺， 右側膝關節周圍備皮、消毒、鋪巾，記為實驗側（Experiment, E）。 根據 Burston等[7]的造模方法，用1 ml 注射器沿脛骨平臺上緣行關節腔注射碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate, MIA)1 mg (50 μl) ，活動大鼠膝關節，讓藥物充分擴散，左側不做任何操作，記為正常側(Normal, N)。 在造模前(第 0 d)、造模后第 7、14、21、28 d 分別測量每只大鼠正常側和實驗側后爪機械疼痛閾值并采集爪印印跡。

1.2 von Frey 測定機械痛閾 在造模前 (第0 d)、造 模 后 第 7、14、21、28 d 時 測 定 機 械 縮 足 閾 值(mechanical withdraw threshold,MWT)。 參照 Sagar 等[8]的測量方法，將待測大鼠置于透明箱中，底部放金屬網架。 行為學測試于每日固定時間進行，測試前將大鼠置于透明箱內適應約1 h，待大鼠安靜，采用不同大小的 von Frey 細 絲（規格為 1，1.4，2,4,6,8,10,15,26 g），按照從小到大的順序依次進行測試，垂直刺激大鼠足底第二三跖骨之間位置。 刺激持續時間為8 s， 大鼠出現縮足或舔足現象時記為陽性，同一大小的von Frey 細絲刺激間隔30 s， 不同大小刺激間隔5 min， 同一細絲刺激5 次出現3 次陽性時記為最小刺激強度。

1.3 大鼠爪印印跡相關參數測量及計算 制作一個長150 cm,寬10 cm 的黑暗狹窄步道，步道底部鋪設同等大小白紙，終點設有光孔，以便大鼠直線向終點光亮處行走。將大鼠后爪均勻蘸取墨水（N 為藍色，E 為紅色）后，置于步道里讓大鼠通過。白紙上印有大鼠后爪印跡，相機拍攝后用于統計分析。

根據Murrell 等[6]的測量方法，本研究測量了3個參數，見圖 1：（1）PL 表示爪印最長距離；（2）TS 表示第一腳趾到第五腳趾的距離；（3）IT 表示第二腳趾到第四腳趾的距離。 選取每張紙上同色的3 個清晰爪印，使用Image J 軟件測量各參數數值，計算足印長度因子(print length factor, PLF)、足趾擴展因子(toe spreading length factor，TSF) 和中間足趾因子(inter toe distance factor, ITF)，計算公式參照Murrell等[6]的計算公式如下：

PLF=(NPL-EPL)/NPL

TSF=(NTS-ETS)/NTS

ITF=(NIT-EIT)/NIT

圖1 爪印印跡 PL、TS、IT 測量方法

1.4 統計學方法 應用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料以x±s 表示。采用重復測量方差分析比較不同時間點實驗側 MWT、PLF、TSF、ITF 的差異性，LSD-t檢驗進行兩兩比較；配對t檢驗比較實驗側與正常側von Frey 機械縮足閾值的差異性；采用Pearson相關系數法進行相關性分析， 以相關系數r表示兩樣本間的相關性。P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 von Frey 機械縮足閾值 造模第0 d 時， 大鼠雙側后爪von Frey 細絲測量的最大反應值均為26 g，雙側 MWT 均為(21.97±5.39)g，兩者無顯著差異。 實驗側MWT 隨造模天數逐漸減小，在第28 d 時為最小值(6.07±1.44)g，造模后第 7、14、21、28 d 的 MWT相比第0 d 時差異顯著(P< 0.05)。而正常側的MWT在造模各時間點比較均無統計學差異(P> 0.05)。 實驗側與正常側間 MWT 在造模后第 7、14、21、28 d比較有顯著差異(P< 0.05)。 見表1 和圖2。

表1 大鼠OA 模型正常側與實驗側后爪MWT比較()

表1 大鼠OA 模型正常側與實驗側后爪MWT比較()

注: 與正常側同一時間比較,①P < 0.05;與同組內造模前(第0 d)比較,②P < 0.05

造模時間(d) 正常側(g) 實驗側(g)0 21.97±5.39 21.97±5.39 7 21.24±5.54 14 23.06±4.96 11.82±2.65 21 21.22±5.53 8.26±1.55 28 22.71±5.12 6.07±1.44

圖2 大鼠OA 模型正常側與實驗側后爪MWT 折線圖

2.2 大鼠爪印印跡相關因子 建立大鼠OA 模型后，隨著造模天數增加，大鼠通過黑暗步道時爪印的 PLF、TSF、ITF 也隨之增加。 造模后第 7、14、21、28 d 的 PLF、TSF、ITF 相比第 0 d 差異有統計學意義(P< 0.05)。 見表 2。

2.3 相關性分析 大鼠爪印印跡PLF、TSF、ITF 3個因子與 MWT 呈正相關（P< 0.05），其中 PLF 相關性顯著。 見表3。

表2 大鼠OA 模型爪印印跡相關因子PLF、TSF、ITF 比較()

表2 大鼠OA 模型爪印印跡相關因子PLF、TSF、ITF 比較()

注:與同組內造模前(第0 d)比較,①P ＜ 0.05

造模時間 (d) PLF TSF ITF 0 0.02±0.01 0.03±0.02 0.04±0.02 7 0.12±0.04 0.12±0.04 0.05±0.02 14 0.18±0.02 0.14±0.04 0.07±0.04 21 0.23±0.05 0.16±0.05 0.09±0.03 28 0.31±0.04 0.21±0.06 0.10±0.04

表3 大鼠OA 模型爪印印跡相關因子PLF、TSF、ITF 與MWT 相關性分析

3 討論

利用MIA 造模是研究OA 疼痛時較為常見的一種造模方法，MIA 通過破壞軟骨細胞糖酵解，導致關節軟骨丟失以及軟骨下骨重建，疼痛變化顯著[9]。 本研究結果顯示，隨著造模時間延長，MWT 逐漸降低，大鼠實驗側后肢的疼痛程度不斷加重，這與其他文獻報道的結果相一致[8-10]，證實本研究成功建立了MIA誘導的OA 疼痛模型。

爪印印跡相關因子起初應用于坐骨神經及跟腱功能的評估，功能受損后，動物后爪行走狀態以及與接觸地面的著力點都會發生改變，因此，爪印印跡間接反映了功能受損程度。 但是， 在OA 模型中， 動物是否會因為疼痛導致行走步態發生改變，致使爪印印跡的相關測量數值變化還尚未研究。 本研究結果顯示， 爪印印跡相關因子PLF、TSF 及ITF隨造模時間逐漸增大，3 個因子的數值代表了實驗側與正常側PL、TS、IT 之間的差異， 數值越大表示差異越明顯。相關性分析顯示，3 個因子均與反應疼痛程度的MWT 呈正相關，且PLF 相關性顯著。筆者認為，一方面，由于膝關節軟骨退變、骨贅形成等導致關節活動受限，關節運動功能障礙引起行走步態改變；另一方面，關節病理學改變后，一系列炎癥因子和致痛因子引起中樞及外周神經敏化，促進疼痛信號傳遞，痛覺敏化使大鼠后爪蜷縮，行走時接觸地面范圍及受力減少。所以在OA 模型中，大鼠爪印印跡相比正常側有明顯改變。 因此，爪印相關因子可以用來反映大鼠OA 模型的疼痛， 并且成為可能替代von Frey 的另一種疼痛評估方法。

近年來，CatWalk 步態分析儀逐漸被用于評估多種疼痛模型的疼痛學行為[11-12]。 它使用便捷、測量迅速且相較于von Frey 更為客觀，但價格昂貴這一缺點使多數研究者望而卻步， 這可能也是von Frey仍然被廣泛使用的原因之一。 爪印印跡分析只需研究者自制避光狹長走道，配備不同顏色染料，成本極低。 爪印印跡也與動物的步態相關，由于步態改變，疼痛一側的后爪接觸范圍縮小，間接反映了實驗動物的疼痛程度。相較于von Frey，爪印印跡分析避開了人為主觀評估這一因素， 應用Image J 標尺直接測量，增加了其客觀性。 而在動物本身的影響性這一方面，von Frey 雖然在測量前先讓動物適應一段時間，盡量減少這種影響，但是動物自身對疼痛的敏感性這一因素是不可避免的， 包括CatWalk步態分析儀。

雖然本研究通過相關性分析證實了爪印相關因子與經典的von Frey 機械縮足閾值具有相關性，但是本研究樣本量有限，后續尚需擴大樣本量后進行深入探究。 綜上，爪印印跡分析成本低、易操作、結果客觀，在今后的實驗性疼痛評估中可能具有重要意義。