黃芩湯對UC模型大鼠PINK1/Parkin通路的作用研究

苗金雪，馬旭冉，馮雪，李晗，王嵐，高曦，張良，宋紅新，王敦方，劉雅清，李佳，楊偉鵬，*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.清華大學，北京 100083)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性炎癥性疾病，好發于中青年，臨床表現為持續或反復發作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身癥狀，病程多在4～6周以上[1]，嚴重影響患者生活質量。黃芩湯源于張仲景的《傷寒論》，由黃芩、芍藥、大棗及甘草4味藥組成，其主治為“自下利”，具有清熱止痢、和中降逆的功效，被歷代醫家奉為治痢祖方，在臨床上被廣泛應用于潰瘍性結腸炎及結腸癌等消化系統疾病。近年來，課題組一直致力于對黃芩湯的研究。有研究表明，人前梯度蛋白2(anterior gradient-2,AGR2) 基因可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 誘導的腸黏膜屏障損傷，保護線粒體功能，這種保護作用可能是通過誘導線粒體自噬發生實現的[2]；自噬可通過調節腸道菌群和黏液分泌來維持腸道內穩態，達到減輕UC的作用[3]。臨床上也有案例表明潰瘍性結腸炎患者結腸組織中存在線粒體自噬現象，且其主要通路蛋白PINK1與Parkin的表達量也存在差異,推測PINK1/Parkin介導的線粒體自噬可能是潰瘍性結腸炎的潛在保護機制[4]。本實驗擬從黃芩湯對PINK1和Parkin蛋白表達的影響入手，探究黃芩湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中線粒體自噬的影響。

1 實驗材料與研究方法

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，體質量(190±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。動物飼養于中國中醫科學院中藥研究所清潔級動物房，溫度為(22±2.5)℃，濕度為(40±20)%。

1.2 藥品與試劑

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、芍藥(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大棗(ZiziphusjujubaMill)飲片均購于北京華邈藥業有限公司，經鑒定為合格藥材。黃芩湯煎劑按照文獻方法制得[5]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid ,TNBS,美國sigma公司)；柳氮磺胺吡啶腸溶片(salazosulfapyridine，SASP，批號：09200506，上海信誼天平藥業有限公司)；兔抗鼠PINK1單克隆抗體、兔抗鼠Parkin單克隆抗體(美國CST公司，貨號分別為6946T、2132S)。

1.3 實驗儀器

電泳儀(美國Bio-Rad公司);搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);發光儀(Clinx Science Instruments);CKX41 OLYMPUS倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司);電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);HH系列數顯恒溫水浴鍋(金壇市科儀器有限公司)。

1.4 造模方法

采用Morris等[6]文獻報道的造模方法制備UC大鼠模型，在適應性飼養5 d后，禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(40～60 mg/kg)進行麻醉,然后將TNBS混合溶劑(TNBS 0.18 mL/100 g+50%乙醇 0.25 mL)注入大鼠肛門內約8 cm處，然后立刻將大鼠倒置，捏緊肛門，防止溶劑流出。正常組麻醉后給予同體積的生理鹽水，后續操作與造模大鼠相同。造模結束約3 h后大鼠陸續開始恢復意識，術后進行常規飼養。

1.5 實驗分組及樣本的采集

大鼠按照體質量隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥SASP組(為0.5 g/kg)和黃芩湯高、中、低劑量組(20 、10、5 g/kg)。造模后第4天開始灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續給藥7 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，然后進行眼眶取血，注意小心操作，避免溶血，所取得的大鼠血液以3 000 r/min離心15 min后，吸取分離上層血清，冷凍于-20 ℃備用。取血后脫頸處死大鼠，解剖取出結腸組織，生理鹽水清洗腸道內容物，將腸段分為3部分，一部分凍存于-80 ℃備用，一部分用10%多聚甲醛固定，留作后續的病理切片及HE染色，一部分用4%的戊二醛固定，4 ℃保存，留作電鏡觀察。

2 檢測指標及方法

2.1 行為學指標

觀察造模前后及給藥前后的大鼠精神狀態、行為體征、糞便性狀，記錄其進食量及體質量，按UC活動指數(DAI)評分標準[7]進行評分，評分標準如下：體質量無下降，大便性狀正常，無便血，記0分；體質量下降<5%，大便略松散，有隱性出血，記1分；體質量下降<10%，大便松散，肉眼可見出血，記2分；體質量下降≥10%，腹瀉，血便，記3分。

2.2 病理學指標

高倍鏡下觀察各組大鼠結腸組織形態。取甲醛固定好的結腸組織，進行包埋、切片、HE染色，高倍鏡下選取視野，根據病變損傷程度進行評分，評分標準[8]如下：未見明顯損傷，記0分；10%高倍鏡視野中呈低水平淋巴細胞浸潤，腸絨毛結構無破壞，記1分；10%～25%高倍鏡視野中呈中等水平淋巴細胞浸潤，腸隱窩加深，腸壁增厚單位侵及肌層，無潰瘍，記2分；25%～50%高倍鏡視野中呈高水平淋巴細胞浸潤，血管增生，腸壁增厚且侵及肌層，無潰瘍，記3分；明顯的淋巴細胞浸潤，血管增生，腸隱窩加深變形，腸壁增厚且侵及肌層，伴潰瘍，記4分。

2.3 黃芩湯對大鼠結腸組織中線粒體自噬的影響

將固定在4%戊二醛中的結腸組織進行切片、固定、梯度脫水、包埋、固化、切成超薄片、醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，進行透射電鏡觀察和拍照。

2.4 黃芩湯對大鼠結腸中PINK1、Parkin表達的影響

將大鼠的結腸組織充分裂解后提取總蛋白， BCA試劑盒檢測組織中的蛋白濃度，按照所得濃度以不同比例加入蛋白上樣緩沖液，蛋白樣品變性，電泳分離，轉膜，封閉，TBST洗膜，加入PINK1和Parkin抗體，4 ℃反應過夜后二次洗滌，加入相應的二抗并在室溫下孵育2 h，再次洗滌后加入發光液曝光，圖片掃描，分析條帶灰度值。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 行為學指標

造模后的大鼠出現不同程度的精神萎靡，倦怠嗜臥，被毛蓬亂無光澤，食欲下降，體質量減輕，糞便不成形，個別大鼠出現膿血便。在給藥7 d后，各給藥組的體質量及食量與模型組相比均有不同程度的增加，尤其以SASP組和黃芩湯中劑量組改善明顯，模型組并未出現明顯好轉。大鼠DAI評分見表1,進食量及體質量統計結果見圖1、2。

表1 各組大鼠造模后DAI評分分)

圖1 黃芩湯對UC大鼠體質量的影響

圖2 黃芩湯對UC大鼠進食量的影響

3.2 病理學指標

肉眼觀察UC大鼠的結腸組織，正常組結腸組織外觀正常，顏色正常，未見充血，漿膜面、黏膜面及肌層未見明顯病變，模型組大鼠結腸組織存在充血現象，外觀顏色發生改變，呈現紅褐色，腸黏膜及肌層明顯變薄，個別大鼠結腸與周邊組織發生黏連，并伴有惡臭味，陽性藥SASP組未見明顯的充血現象，病變程度減輕，黃芩湯3個劑量組大鼠結腸組織外觀顏色、充血及肌層厚度等與模型組相比均有不同程度的改善，見圖3。HE染色結果見圖4，結腸組織病理評分結果見表2。

圖3 各組大鼠結腸組織對比

注:A：正常組;B:模型組;C：陽性藥SASP組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組。圖4 各組大鼠結腸組織病理切片(100×)

表2 各組大鼠結腸組織病理學評分分)

鏡下觀察結腸組織：正常組大鼠結腸黏膜完整，絨毛排列整齊，未見壞死、脫落，肌層結構正常。模型組大鼠明顯可見炎細胞浸潤，結構腺體消失，杯狀細胞明顯減少，腸絨毛腫脹而短小，黏連成片甚至缺失，黏膜層變薄。黃芩湯三個劑量組與模型組相比結腸黏膜炎性細胞浸潤數量明顯減少，腸壁結構紊亂程度減輕，病理變化得到不同程度的改善，其中以黃芩湯中劑量組最為明顯。

3.3 黃芩湯對大鼠結腸組織線粒體自噬的影響

透射電鏡下觀察線粒體的超微結構，正常組線粒體形態結構正常，體積正常，線粒體嵴結構完整，邊緣整齊。而模型組可觀察到線粒體腫脹，體積增大，嵴變短并且邊移，基質顆粒減少，可觀察到空化現象。各給藥組也可觀察到不同程度的線粒體結構損傷及自噬現象的發生，可見自噬小體與自噬溶酶體。結果見圖5。

注:A：正常組;B:模型組;C：陽性藥SASP組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組。圖5 黃芩湯對UC大鼠結腸組織中線粒體自噬的影響

3.4 黃芩湯對UC大鼠結腸組織中PINK1/Parkin蛋白表達的影響

Western blot結果如圖6和圖7所示。UC模型組大鼠結腸組織中Parkin蛋白的表達量低于正常組(P<0.01)，陽性藥組與黃芩湯各劑量組中PINK1與Parkin的表達量均有不同程度的升高，提示給藥后大鼠的線粒體自噬強度增強，結果可見表3。模型組中PINK1蛋白表達量較正常組增加，其可能原因為線粒體損傷后該蛋白無法進入線粒體內被降解，大量聚集在線粒體外膜。

注：A：正常組;B:模型組;C：陽性藥組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組;與正常組比較，△P<0.05,△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖6 黃芩湯對結腸組織中PINK1表達量的影響

注：A：正常組;B:模型組;C：陽性藥組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組;與正常組比較，△P<0.05, △△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖7 黃芩湯對結腸組織Parkin表達量的影響

表3 黃芩湯對UC大鼠組織中PINK1和Parkin蛋白表達的影響

4 討論

線粒體在細胞的生命活動過程中起著至關重要的作用，它不僅能為細胞的生命活動提供能量與生物合成的底物，還可以清除掉胞內損傷或衰老的細胞器及線粒體受損時產生的過量線粒體反應活性氧類(mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)，減輕線粒體損傷對細胞的傷害，維持線粒體內的動態平衡，保障生命活動的順利進行，這一過程被稱為線粒體自噬。同時，線粒體還是固有免疫反應最基本的信號平臺之一[9]，在調節細胞對應激源的適應中起著至關重要的作用，包括受損的生物發生、線粒體DNA損傷、衰老、營養限制以及分裂與融合之間的平衡失常，如果不加以控制，這些過程會通過活性氧對核酸、脂質和蛋白質造成損傷，導致持續的氧化應激，氧化應激通過轉錄后修飾(包括泛素化)來調節線粒體動力學，這反過來又導致受損的線粒體的聚集，最終導致細胞死亡和更廣泛的組織功能障礙[10]，從而導致多種疾病的發生。另一方面，線粒體自噬與炎癥似乎也有著密切的聯系，線粒體ROS可通過激活核轉錄因子、腺苷酸活化蛋白激酶、一氧化氮合成酶等轉錄因子，共同參與炎癥調控[11]，在炎癥過程中，線粒體既是ROS的重要來源，又是其損傷靶點，二者交互作用，形成惡性循環，共同調控機體炎性反應[12]。課題組前期研究發現，黃芩湯可以發揮抗氧化應激作用[13]，減少細胞內過氧化產物的累積，并且能夠抑制細胞炎性因子的表達[14-15]，據此提出假設，黃芩湯能夠緩解潰瘍性結腸炎大鼠的氧化應激反應可能與調控線粒體的自噬水平有關。

PINK1/Parkin通路是目前研究較多的線粒體自噬通路，其表達量在一定程度上反映了線粒體自噬的水平。有研究證實，PINK1和Parkin蛋白可以通過清除受損線粒體來預防炎癥[16-17]。PINK1是一種有581個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在正常生理狀態的線粒體中，PINK1會不斷地被轉移至線粒體內膜，被線粒體內膜蛋白酶切割清除，因此，正常情況下PINK1在細胞中保持著較低水平。Parkin是一種具有465個氨基酸的E3泛素連接酶，具有連接酶活性。在機體受到應激源刺激時，線粒體膜電位發生去極化，氧化呼吸異常，產生大量ROS引起線粒體氧化損傷，PINK1進入線粒體的路徑被阻斷，聚集于線粒體外膜，并將Parkin募集至線粒體[18]，構建多聚泛素鏈泛素化線粒體相關成分蛋白與自噬受體蛋白結合，同時，受體蛋白的LIR(LC3相互作用區域)與錨定于自噬囊泡上的微管相關蛋白輕鏈3(microtublue associated protein light chain 3,LC3)結合，構成線粒體自噬體，而后與溶酶體結合成線粒體自噬溶酶體，最終被水解酶水解[19]。因此當線粒體穩態遭到破壞時，PINK1在組織中大量聚集，這與實驗結果中Western Blot法檢測到模型組大鼠組織中PINK1蛋白的表達量增多的現象符合，線粒體自噬啟動時，PINK1蛋白會聚集Parkin蛋白于線粒體外模上，導致組織中的Parkin表達量增多。綜上所述，黃芩湯可以促進潰瘍性結腸炎大鼠組織中PINK1和Parkin蛋白表達。

本次實驗通過對PINK1/Parkin自噬通路相關位點蛋白的檢測，探究黃芩湯對UC大鼠組織中線粒體自噬的影響。實驗結果顯示，黃芩湯可以明顯改善UC模型大鼠的體征及DAI評分，電鏡觀察到各給藥組大鼠組織中自噬小泡與溶酶體等線粒體自噬結構，說明組織中發生了線粒體自噬，并且PINK1與Parkin的表達量明顯增加，說明給藥后大鼠結腸組織中PINK1/Parkin自噬通路被激活，啟動線粒體自噬，提示黃芩湯可能通過影響PINK1和Parkin蛋白的表達，激活線粒體自噬，清除組織內受損的線粒體，從而達到治療潰瘍性結腸炎的效果。