膈下逐瘀湯加減方對氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕模型大鼠DA、NE表達的影響

程英龍，馬曉榮，胡喜姣，劉麗

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

衣原體感染和淋病等性傳播疾病都有導致盆腔炎性疾病和不孕癥的可能性[1]。截止到2013年全球不孕癥的患病率達到15%，我國不孕癥的發病率也有逐年上升的趨勢[2]。其中輸卵管性不孕占不孕女性的30%～40%[3-4]。不孕癥作為生活的一個負性事件嚴重影響著患者及家屬的身心健康，甚至成為對家庭穩定具有極大威脅的因素。不孕癥的治療在臨床上取得了較好的療效，這其中包括西醫的輔助生殖技術、宮腹腔鏡等手術治療手段，因其存在一定的局限性很難在臨床治療中推廣普及。課題組前期實驗研究證明了GD可以明顯改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達水平，從而對輸卵管炎性不孕癥起到積極的治療作用[5-7]。現在原課題的研究結果基礎上，通過觀察GD對模型大鼠中醫證候評分、血流變、DA和NE的表達水平、輸卵管病理表現及輸卵管組織形態來探討GD治療氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠100只，鼠齡56～84 d，體質量(200±20)g，實驗大鼠均來源于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，編號:SCXK(黑) 2015-004。將大鼠飼養于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，溫度為20～22 ℃，相對濕度保持在40%左右，8:00—20:00人工照明12 h，分籠飼養，5只/籠，標準喂養飼料，自由飲水。

1.2 試劑與藥品

金黃色葡萄球菌：菌號FSCC223005，濃度為4×109/mL，北京東方賽瑞生物技術有限公司；DA、NE酶聯免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；水合氯醛、烏拉坦：上海山浦化工有限公司；膈下逐瘀湯加減方：延胡索、赤芍各20 g，牡丹皮、桃仁、川芎、枳殼、香附、烏藥、地龍、鱉甲各15 g(草藥均由黑龍江中醫藥大學中草藥局提供，藥品制備：以上飲片，按比例水煎煮，10倍量水一煎，8倍量水二煎，合并兩煎藥液， 水煎液濃縮適當濃度移至蒸發皿中，最后移至真空干燥箱中干燥至衡重，得膈下逐瘀加減方水煎液干粉以保證藥物的穩定性)。

1.3 實驗儀器

SGD-1聲、光、電刺激儀(中國中醫科學院西苑醫院基礎研究室研制)；KDC-16HR高速低溫離心機(科大創新股份有限公司)；LBY-N6 Compact全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)；透射電鏡(JEM-1220，日本電子有限公司)；光學顯微鏡(CX41，日本OLYMPUS公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

適應性喂養7 d后，將100只SD大鼠隨機分為空白組(K)、病證結合組(B)、膈下逐瘀湯高劑量組(H)、膈下逐瘀湯中劑量組(M)、膈下逐瘀湯低劑量組(L)，每組20只。

2.2 模型制備及干預

實驗第1天，K組不予處理，B組及H、M、L組進行手術造模。將10%水合氯醛按0.4 mL/100 g對大鼠進行腹腔注射麻醉，術區備皮，常規消毒后取近脊柱側肋緣過腎區約5 mm處，開長約1 cm左右橫切口，開腹后剝離周圍組織，暴露子宮、輸卵管及卵巢，然后向輸卵管-卵巢方向注入金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，術畢逐層關腹，再次進行術區消毒。對側輸卵管操作同上。疾病造模后恢復7 d，開始制備氣滯血瘀證候模型，給予B組、H、M及L組大鼠聲、光、電+夾尾刺激，連續刺激21 d。具體刺激方法為：大鼠足底電擊刺激，電擊強度為25～35 V，每次持續電擊時間為1 min；噪聲刺激5～15 kHz，噪音刺激每次持續1 min；閃爍光刺激：以1～3 kHz的強度給予大鼠刺激，每次刺激持續時間為1 min，聲、光、電刺激均是每間隔15 min刺激1次。應用以上3種刺激方法對大鼠進行循環刺激，共刺激10 h/d；夾尾:1次/h，每次刺激時間為4 min，8次/d。藥物干預方法：治療組分別按膈下逐瘀湯加減方高、中、低劑量組分別給予模型大鼠灌胃膈下逐瘀湯加減方水煎液濃縮干粉，加水制成相當于高劑量1.50 g/mL，中劑量0.75 g/mL，低劑量0.38 g/mL的混懸液；大鼠灌胃劑量按照0.02 mL/g鼠質量給藥。模型對照組灌服等劑量蒸餾水，在造模第29天開始，每日上午9:00行灌胃1次，連續給藥4周。

2.3 取材方法及檢測指標

實驗給藥治療28 d后，大鼠禁食不禁水12 h，次日9:00用20%烏拉坦(1 mL/100 g)對大鼠進行腹腔注射麻醉后，行腹主動脈采血，一部分血樣用于測定血流變各項指標，余下血樣靜置4 h( 溫度為4 ℃)，按4 000 r/min低溫離心10 min后取其血清，按照酶連免疫法試劑盒說明書進行DA、NE含量測定。取模型大鼠雙側輸卵管組織，行HE染色制備病例切片及進行電鏡觀察輸卵管組織形態。

2.4 數據統計與分析

3 實驗結果

3.1 GD對模型大鼠中醫證候積分的影響

與K組相比，B組中醫證候積分有顯著差異(P<0.01)，表明模型制備成功。

與B組相比較，H、M組中醫證候積分有統計學差異(P<0.05)，說明高、中濃度GD均能明顯降低模型大鼠的氣滯血瘀證候評分。見表1。

表1 氣滯血瘀證候總積分

3.2 GD對模型大鼠血流變指標影響

與K組相比，B組的血漿黏度、全血黏度30及還原黏度3.0均極顯著升高，P<0.01；與B相比，H、M兩組全血黏度30、血漿黏度和還原黏度3.0下降極其顯著，P<0.01，L組能明顯下調還原黏度3.0，P<0.05，血漿黏度、全血黏度3.0下降極其顯著，P<0.01。見表2。

表2 GD對大鼠血漿黏度、全血黏度3.0、還原黏度3.0的影響

3.3 GD對模型大鼠DA、NE表達的影響

與K組相比，B組DA、NE表達水平均有顯著差異(P<0.05)；與B組比較，H、M組的DA、NE差異現顯著(P<0.05)。見表3。

表3 GD對大鼠血清DA、NE表達的影響

3.4 GD對模型大鼠輸卵管病理學影響

B組大鼠輸卵管細胞排列較紊亂，胞體腫脹，部分細胞核腫脹，細胞黏連充血；H組：輸卵管管腔上皮輕度脫落，輸卵管周圍可見少量炎細胞；M組：輸卵管管腔內可見滲出液，輸卵管周圍大量炎細胞，胞體輕度腫脹；L組：輸卵管管腔少量炎細胞，上皮細胞脫落，部分壞死，輸卵管周圍少量炎細胞，胞體腫脹明顯。見圖1。

3.5 電鏡觀察GD對模型大鼠輸卵管病變的影響

K組：輸卵管組織形態完好，無明顯實質性變性、壞死，纖毛豐富，輸卵管管腔無狹窄，無結締組織增生及炎細胞浸潤。B組：大鼠輸卵管均呈現不同程度的病態組織形態，4例較為嚴重。

H、M、L三組(其余各治療組)：輸卵管組織形態均有著不同程度的改善作用。見表4。

注：K.空白組;B.病證結合組;H.GD高劑量組;M.GD中劑量組;L.GD低劑量組。圖1 各組大鼠輸卵管HE染色圖(×400)

表4 電鏡觀察輸卵管組織形態學結果

4 討論

“氣滯血瘀證”是輸卵管炎性不孕最為常見的證型[8]。因此課題組對氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥作為重點研究。本研究所用方劑是在膈下逐瘀湯原方的基礎上去五靈脂、紅花、當歸、甘草，加地龍、鱉甲二味而成膈下逐瘀湯加減方。方中牡丹皮可涼血活血，為君藥，配以烏藥，有補有泄。赤芍止痛散瘀、清熱涼血，是為臣。 鱉甲軟堅散結，與牡丹皮、桃仁相配，可化瘀除癥，通管腔之塞物；川芎配伍枳殼，活血、行氣、消瘀滯；地龍配川芎，活絡通經；延胡索、香附、烏藥皆入肝經，共奏開郁行氣、散結止痛之功。劉師應用該方并以“活血化瘀，行氣止痛”為法，在臨床治療輸卵管炎性不孕時，療效頗佳。課題組前期研究表明GD可以明顯改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達水平，減少對輸卵管損傷，發揮其抗炎、抑制輸卵管黏連及纖維化，從而對輸卵管炎不孕癥起到積極的治療作用。本實驗旨在通過觀察GD對模型大鼠中醫證候評分、血流變、DA和NE的表達水平、輸卵管病理表現及輸卵管組織形態來探討GD治療氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥的作用機制。

血流變[9]在中醫血瘀證診斷標準中是一項重要內容。因此，血液流變學是可以作為藥物對血瘀證改善程度的一項客觀指標[10]。本研究結果顯示，高、中、低劑量的GD均能夠在不同程度上改善模型大鼠血流變學指標。這從血液流變學角度證實了GD能夠改善模型大鼠的“血瘀”狀態。單胺類神經遞質是中樞神經遞質，其所代謝的產物對神經、內分泌等系統均具有調節作用，并且對情緒、睡眠覺醒等生理活動產生著重要的影響[11]。DA表達的降低會引起意志活動的減少，情感淡漠等情志異常問題，同時也會影響5-HT神經能元及其通路，進而引起抑郁的發生，NE亦是導致抑郁的一個重要介質[12]。有研究表明[13-14]DA、NE與肝郁氣滯證關系十分密切。《景岳全書·婦人規》載曰:“產育由于氣血，氣血由于情懷，情懷不暢，則沖任不充，沖任不充則胎孕不受。”中醫學認為情志與肝的關系最為密切，沖、任、督三脈皆起于胞宮而通于肝，故肝、沖任督脈、胞宮關系密切相關。正所謂“思慮無窮，皆難得子”，可見不良的情緒刺激，會產生惡性循環，加重不孕病情。因此對不孕婦女情志的調節是該病在治療過程中不可忽視的一部分。而在中樞神經系統中，NE、DA具有調節情緒的生理功能，并且DA是 NE 的前體，參與著心理應激活動以及精神情緒活動，當DA、NE表達異常時，就會出現情緒的異常。在本研究中，病證結合組的 DA、NE含量較正常組明顯下降，提示模型大鼠存在肝郁氣滯，高、中劑量組的膈下逐瘀湯能夠明顯升高 DA、NE 含量，從而改善大鼠了“肝郁”狀態，這都客觀證實了GD具有疏肝行氣作用，可以改善大鼠的“氣滯血瘀”證候。另一方面，從組織病理學來看，慢性輸卵管炎的病理表現形式包括慢性間質性輸卵管炎、輸卵管積水以及輸卵管積膿等，具體可見輸卵管壁間結締組織增生纖維化，管壁增厚或變硬，輸卵管及周邊組織黏連，輸卵管腔內積水、積膿等[15]。久之，導致輸卵管纖維化，輸卵管僵硬變形，導致婦女不孕。因此，在本研究中，我們著重從光鏡、電鏡等不同角度觀察GD對模型大鼠輸卵管組織形態以及病理學方面的影響，更進一步證實了GD的有效性。

綜上可見，GD通過改善模型大鼠中醫證候積分、血流變、DA與NE的表達、輸卵管病理表現及輸卵管組織形態，對氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥起到積極的治療作用。