貓須草納米分散液的制備及其降尿酸活性研究

劉 睿，羅 超，朱 君,

(1. 納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心，上海 200241)(2. 上海健康醫(yī)學(xué)院 上海市分子影像學(xué)重點實驗室，上海 201318)

1 前 言

納米中藥是近年來迅速發(fā)展起來的一個新的研究領(lǐng)域。納米中藥制劑具有良好的藥物可控性、遞送性、緩釋性以及生物相容性等特性，可提高藥物的生物利用度、降低用藥量、減少藥物毒副作用，已成為材料學(xué)科、生命學(xué)科和中藥學(xué)科的一個新的交叉前沿和熱點[1]。此外，中藥納米制劑作為特效藥物，其對中藥基礎(chǔ)性發(fā)展的重要性已得到了認(rèn)可[2]，例如在腫瘤等疑難病治療方面顯示出驚人的效果[3]。由此可見，納米技術(shù)與中醫(yī)藥的結(jié)合已經(jīng)對醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響。

納米技術(shù)與中草藥結(jié)合的一類重要用途是采用納米粉碎技術(shù)制備礦物藥和難溶性藥物等中藥的超細(xì)粉。粉碎后的中草藥性能具有一定優(yōu)勢，例如粒徑的減小使得藥物顆粒的比表面積迅速增大，藥物的活性和生物利用率大幅提高，從而增加了療效、減少了用藥量；另外，還能改善藥物的溶出度、控制藥量等[4]。此類納米粉碎技術(shù)主要包括：超微粉碎技術(shù)、固相分散技術(shù)、包合技術(shù)等[5]。研究人員根據(jù)中草藥含有的本質(zhì)素、纖維、膠質(zhì)、脂肪、糖類等種類和數(shù)量的不同，選擇不同的納米粉碎技術(shù)[6]。但是通過納米粉碎技術(shù)制備的中草藥納米粉很難在水溶液中均勻分散形成穩(wěn)定的分散液。因此，開發(fā)中草藥混懸液成為開發(fā)液體劑型的一種重要方法[7]。例如，研究人員制備了含有多種中草藥成分的固體脂質(zhì)納米粒、納米脂質(zhì)體等混懸液[8-10]。但是目前混懸液制劑多數(shù)是將中草藥中有效成分，特別是油溶性強(qiáng)或者水油都不溶的成分進(jìn)行包裹和納米化[11]。如何制備中草藥藥材均相、穩(wěn)定的分散液仍具有一定的挑戰(zhàn)性。

貓須草主要包括黃酮類、酚類、木脂素類、萜類及一些其它類化合物，具有抗炎、利尿、降壓、降糖、抗氧化、保肝護(hù)肝和抗增殖等作用，可通過降尿酸、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗纖維化等對痛風(fēng)各期的病癥發(fā)揮治療作用，且毒副作用小，值得深入研究。但是到目前為止，關(guān)于貓須草納米粉的研究報道仍然很少。因此，本文開發(fā)了一種貓須草納米分散液的制備方法。通過建立大鼠的高尿酸模型，研究了貓須草納米分散液的降尿酸作用；通過考察對其肝臟指標(biāo)的影響，探究了貓須草納米分散液的毒副作用；通過與人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)細(xì)胞共孵育，檢測了貓須草納米分散液的細(xì)胞毒性。本文的研究結(jié)果表明，貓須草納米分散液的劑型在降尿酸方面具有潛在的應(yīng)用價值，并能進(jìn)一步為納米中草藥的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2 實 驗

2.1 實驗試劑

貓須草(上海健康醫(yī)學(xué)院提供)，糊精、非布司他(Feb)、氧嗪酸鉀(中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供),胎牛血清、F-12K培養(yǎng)基、青-鏈霉素(賽默飛世爾科技公司提供)。

2.2 實驗儀器

細(xì)胞級超微粉碎機(jī)(TYM-8L，濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司)，高壓均質(zhì)機(jī)(GS-120，朗灝孚納米科技(上海)有限公司)，全自動生化儀(AU480，Beckman)，IMark酶標(biāo)儀(Bio-Rad)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、納米激光粒度儀(ZetasizerNano ZS，Malvern)、掃描電子顯微鏡(S-4800，Hitachi)。

2.3 貓須草納米分散液的制備

稱取500 g貓須草純?nèi)~，經(jīng)初步粉碎后，加入50 g糊精，混合均勻后將其置于細(xì)胞級超微粉碎機(jī)料筒內(nèi)，降溫至-10 ℃后開啟機(jī)器工作7 min，制得貓須草超微細(xì)粉。將35 g貓須草超微細(xì)粉與100 mL去離子水混勻，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)處理(工作壓力為160 MPa，循環(huán)往復(fù)5次)，收集均質(zhì)后的液體，獲得貓須草納米分散液。

作為參考組，稱取35 g貓須草純?nèi)~，經(jīng)初步粉碎后與100 mL去離子水混勻，于100 ℃回流1 h，收集過濾后的液體，獲得貓須草水提液。

2.4 貓須草納米分散液的表征

利用納米激光粒度儀檢測分散液的粒徑分布：將一定濃度的納米分散液加入去離子水中，經(jīng)超聲分散3 min后移入樣品池中，采用納米激光粒度儀進(jìn)行測試。

利用掃描電子顯微鏡觀察分散液的形貌：將分散液滴在鋁箔表面，氙燈下照射干燥后噴金60 s，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.5 細(xì)胞實驗

首先將人肺泡上皮細(xì)胞傳代到96孔板中，細(xì)胞計數(shù)為每孔5×103，并將其置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)在37 ℃下培育24 h；再將濃度分別為300，700和1000 μg/mL貓須草納米分散液的處理組分別加入到96孔板中，孵育24 h。孵育完成后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%細(xì)胞計數(shù)試劑/磷酸緩沖鹽(CCK/PBS)溶液加到各孔中，并再次在培養(yǎng)箱中孵育4 h。用IMark酶標(biāo)儀檢測96孔板各孔在450 nm波長處的吸光度(A值)，計算各組吸光度的均值。以不添加納米分散液的作為陰性對照組，將陰性對照組的吸光度值作為100%的細(xì)胞增殖率，則不同處理組的細(xì)胞活性(%)=處理組的平均吸光度值/對照組的平均吸光度值×100%。以上所有實驗均采用5組以上的平均數(shù)值。

2.6 動物實驗

貓須草具有降尿酸(UA)的作用，為了驗證貓須草納米分散液降尿酸的效果，制作了大鼠的高尿酸模型，即利用氧嗪酸鉀腹腔注射獲得高尿酸模型組(Model)，同時以生理鹽水腹腔注射獲得的為空白對照組(Control)。再向高尿酸模型組分別注射貓須草納米分散液和貓須草水提液獲得納米分散液實驗組(Sample 1)和水提液實驗組(Sample 2)，同時以高尿酸模型組注射常用降尿酸藥Feb為陽性對照組(Feb)。將體重400 g左右的實驗大鼠分為以上5組，每組10個樣本。其中，實驗組腹腔注射5 mL/kg樣品(折算后給藥劑量為1.75 g/kg)，陽性對照組腹腔注射8 mg/kg的Feb。觀察給藥后大鼠的一般表現(xiàn)，并在給藥后24 h將其處死取血，靜置離心取血清在全自動生化儀上分別檢測UA值、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)值和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗的方法比較各組的均值并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，概率P值小于0.05時則認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果與討論

貓須草純?nèi)~經(jīng)剪切、研磨后，高壓均質(zhì)成固含量為3.5%的貓須草分散液(如圖1所示)，該分散液3 h內(nèi)未見沉淀。實驗表征了貓須草納米分散液的形貌、粒徑和剪切面電位(Zeta電位)。圖2a為納米分散液的SEM照片，由圖可知，納米分散液呈顆粒狀，單分散性很好，未出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒粒徑在100 nm左右。由圖2b中的水合粒徑分布圖可知，納米分散液的平均水合粒徑為130.7 nm，分布較為集中。此粒徑大于SEM觀測的結(jié)果，這是由貓須草除有效成分外含有的木質(zhì)素、纖維等易于通過氫鍵作用吸附水分子形成絡(luò)合水所致。綜上，本實驗成功制備了貓須草納米分散液，其較小的粒徑及較好的單分散性有利于其在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，可以更容易地被生物體吸收后產(chǎn)生藥物作用。納米分散液的Zeta電位為-17.6 mV，這使得溶液中的納米顆粒具有較好的斥力,不易團(tuán)聚。

圖1 貓須草納米分散液制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the processing of orthosiphon stamineus nano-dispersion

圖2 貓須草納米分散液的SEM照片(a)和水合粒徑分布圖(b)Fig.2 SEM image (a) and size distribution (b) of the orthosiphon stamineus nano-dispersion

圖3為貓須草納米分散液對大鼠血清UA水平的影響。由圖3可知，空白對照組的UA值為87.8 μmol/L，高尿酸模型組的UA值為178.1 μmol/L，約為空白對照組的2倍；陽性對照組的UA值為42.7 μmol/L，顯示出了預(yù)期的降尿酸作用(P<0.001)，該結(jié)果表明實驗造模成功。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，納米分散液實驗組大鼠血清中的UA值為138.6 μmol/L，相對于高尿酸模型組其對UA的抑制率為22.1%，具有較好的降尿酸作用(P<0.05)；水提液實驗組大鼠血清中的UA值為158.5 μmol/L，相對于高尿酸模型組其對UA的抑制率為11.0%，也表現(xiàn)出降尿酸作用(P<0.05)。但從兩個實驗組對UA的抑制率來看，納米分散液表現(xiàn)出更好的降尿酸作用，其原因可能在于貓須草納米化后，有效成分溶出更高，更有利于機(jī)體對有效成分的吸收。

圖3 貓須草納米分散液對大鼠血清尿酸水平的影響Fig.3 Effect of olthosiphon stamineus nano-dispersion on serum UA level in rats

為進(jìn)一步探究貓須草納米分散液的毒副作用，研究了納米分散液對肝臟指標(biāo)的影響。圖4a和4b分別為納米分散液對大鼠血清中ALT和AST水平的影響。由圖4a可知，空白對照組和高尿酸模型組的ALT值接近，分別為34.2和34.4 U/L；陽性對照組的ALT值為29.0 U/L，相對于高尿酸模型組下降了15.7%，未見明顯的肝損傷；納米分散液實驗組血清中的ALT值為31.6 U/L，相對于高尿酸模型組下降了8.1%，也未見明顯的肝損傷。同樣地，如圖4b所示，空白對照組和高尿酸模型組的AST值分別為95.5和105.4 U/L，高尿酸模型組表現(xiàn)出了輕微的肝損傷;陽性對照組的ALT值為93.4 U/L，未見明顯的肝損傷;納米分散液實驗組血清中的AST值為109.6 U/L，相對于高尿酸模型組上升了3.9%，但由于該實驗組的標(biāo)準(zhǔn)偏差(17.6)較大，故并未顯示出統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。以上結(jié)果表明，樣品組的ALT和AST水平相對于高尿酸模型組均未顯示出明顯的肝損傷。

圖4 貓須草納米分散液對大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(a)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(b)的影響Fig.4 Effect of orthosiphon stamineus nano-dispersion on serum ALT (a) and AST (b) level in rats

圖5為貓須草納米分散液對HPAEpiC細(xì)胞活性的影響。如圖5所示，隨著納米分散液濃度的增加，細(xì)胞存活率相對于對照組略有上升。但在相對大劑量(1000 μg/mL)的條件下，納米分散液與HPAEpiC細(xì)胞共孵育培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢。此結(jié)果表明，貓須草納米分散液與細(xì)胞共同孵育時，細(xì)胞的狀態(tài)良好，表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。

圖5 貓須草納米分散液對人肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effect of orthosiphon stamineus nano-dispersion on HPAEpiC cell viability

4 結(jié) 論

本文采用剪切、研磨和高壓均質(zhì)法制備了貓須草納米分散液，其平均粒徑約為100 nm，Zeta電位呈電負(fù)性。通過建立大鼠的高尿酸模型，研究了貓須草納米分散液的降尿酸作用。結(jié)果表明，相對于高尿酸模型組，納米分散液對尿酸(UA)的抑制率為22.1%；相對于水提液實驗組，納米分散液表現(xiàn)出更好的降尿酸作用。此外，通過考察對肝臟指標(biāo)的影響，探究了貓須草納米分散液的毒副作用。相對于高尿酸模型組，納米分散液對肝臟的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平未見明顯影響，表明貓須草納米分散液未引起明顯的肝損傷。最后，通過與人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)細(xì)胞共孵育，證明了貓須草納米分散液具有較低的細(xì)胞毒性。本文的研究結(jié)果表明貓須草納米分散液在降尿酸方面具有潛在的應(yīng)用價值，能為納米中草藥的應(yīng)用提供理論依據(jù)。