長鏈非編碼RNA TP73-AS1調控miR-181b及其靶基因HMGB1的表達以及對非小細胞肺癌細胞生物學行為的影響

李 超，何 淼，楊桄權，何小艷，陳兆紅

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，2018 年全球新增肺癌209 萬例（占癌癥總數11.6%），死亡176 萬例（占癌癥總死亡18.4%）[1]。根據病理類型可將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩大類，其中NSCLC 最為常見，約占肺癌的85%[1]。雖然近年來，肺癌的研究取得了巨大進展，但是患者的5 年生存率僅約11%[2]，因此尋找新型生物學標志物有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長度超過200 個核苷酸、不能編碼蛋白質的RNA，其廣泛表達于人體各個組織和器官。LncRNA 在細胞增殖和分化、細胞周期、表觀遺傳學和免疫監控中起到重要作用，與腫瘤的發生和發展密切相關[3]。LncRNA TP73-AS1 具有重要的生物學功能，在膀胱癌、結直腸癌、乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤中異常表達，并且與患者預后密切相關[4-7]。TP73-AS1 在NSCLC 中的作用及機制既往少有報道。

LncRNA 與 微RNA（microRNA，miRNA，miR）的相互作用在癌癥發生過程中扮演著重要角色，而miRNA 可以通過調控下游靶基因介導腫瘤的進展[8]。miR-181b 在NSCLC 中表達下調，可發揮抑癌基因的作用[9]。前期，采用生物信息學技術預測到miR-181b 可能是TP73-AS1的靶基因，而高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box-1，HMGB1）可能是miR-181b 的靶基因，因此本研究中首先檢測了NSCLC 組織和細胞中TP73-AS1 的表達水平，隨后探討了TP73-AS1 通過調控miR-181b/HMGB1 軸 對NSCLC 細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響，以期為探尋診治NSCLC 的標志物提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人正常肺上皮細胞BEAS-2B 和人NSCLC細胞（A549 和NCI-H1299）均購自中國科學院上海細胞庫。shRNA-TP73-AS1（shTP73-AS1）及其陰性對照（shRNA-NC，shNC）、miR-181b-模擬物（mimics）及其陰性對照（NCmimics）、miR-181b-抑制子（inhibitor）及其陰性對照（NC-inhibitor）和攜帶有HMGB1 全基因的過表達重組載體pcDNA-HMGB1 以及空載體pcDNA 均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。DMEM 培養液和胎牛血清購自上海藍季科技發展有限公司；CCK-8 試劑盒和Transwell 小室均購自上海宇淳生物科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；轉染試劑LipofectAMINETM2000、PCR 相關試劑盒（包括AMV 反轉錄試劑盒和2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒）、BCA蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒均購自日本寶生物工程株式會社；PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并提供。兔抗人HMGB1 和GAPDH（內參照）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

細胞培養 箱（3110 型）為美國Thermo Electron 公司產品，倒置光學顯微鏡（IX71 型）為日本Olympus 公司產品，電泳儀（164-5050 型）、熒光定量PCR 儀（CFX96 Touch 型）和免疫酶標檢測儀（680 型）均為美國Bio-Rad 公司產品，凝膠成像儀（FP-UVCI-2100 型）為美國Major Science 公司生產，流式細胞儀（FACSCanto Ⅱ型）為美國BD 公司產品。

1.2 患者資料及NSCLC 組織樣本

選取2012 年1 月—2013 年6 月在德陽市人民醫院確診的42 例NSCLC 患者手術切除的癌組織及對應的癌旁組織（距離癌組織≥5 cm）。其中男性26 例，女性16 例；年齡范圍42～69歲，平均年齡（57.34±4.82）歲。所有患者術前均未接受放化療或免疫治療。組織標本收集后立即凍存于液氮罐中，隨后儲存于－80 ℃冰箱保存。術后對所有患者進行門診隨訪和電話隨訪，術后第1 年每3 個月隨訪1 次，隨后每半年隨訪1 次。隨訪截止時間為2018 年9 月。

1.3 細胞培養

正常肺上皮細胞BEAS-2B 以及NSCLC 細胞A549 和NCI-H1299 用含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL 及青霉素100 U/mL 的DMEM培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%培養箱中培養。選取對數生長期的A549 和NCI-H1299細胞，用胰蛋白酶消化后，以1×105個/mL 的密度將2 mL 細胞懸液接種于6 孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%條件下培養24 h。

1.4 實時熒光定量PCR 法檢測腫瘤組織及細胞中TP73-AS1、miR-181b 和HMGB1 mRNA 的表達水平

取50 mg 組織樣本，置于1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 試劑充分勻漿；取BEAS-2B、A549 和NCI-H1299 細 胞5×107個，置于1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 試劑進行處理；室溫靜置5 min 后依次加入氯仿、異丙醇和75% 乙醇溶液提取總RNA，并進一步反轉錄為cDNA（反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s）；隨后，以cDNA 為模板進行PCR擴增（反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20s，共40 個循環；72 ℃ 10 min）。用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，引物序列見表1。

1.5 敲減TP73-AS1 對癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

1.5.1 轉染及轉染效率的檢測

按照LipofectAMINETM2000 試劑盒說明書。制備LipofectAMINETM2000 復合物，每孔加入240 μL無血清雙抗培養液和10 μL LipofectAMINETM2000，溫室孵育5 min；制備DNA 復合物，每孔加入246 μL 無血清培養液和4 μg 質粒（1.0 μg/μL）；將2 個復合物混勻，制成DNA-LipofectAMINETM2000 復合物，溫室靜置20 min。將6 孔板中的細胞用無血清培養液清洗2 次，隨后將復合物加入6 孔板中，溫室培養6 h 后更換為含血清的培養液，繼續培養48 h后進行下一步檢測。

將細胞分為shNC 組（轉入shRNA-NC）和shTP73-AS1 組（轉入shRNA-TP73-AS1）。收集轉染48 h 后的2 組細胞，用實時熒光定量PCR檢測TP73-AS1 的表達水平，實驗步驟同1.4 節。

1.5.2 CCK-8 法檢測細胞的增殖能力

取轉染48 h 后處于對數生長期的細胞，以1×104個/ 孔的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL。在A549 和NCI-H1299 細胞中分別轉染shTP73-AS1、miR-181b-inhibitor 和pcDNAHMGB1，以未轉染細胞作為對照組。待細胞貼壁后，分別于培養0、24、48、72 和96 h 時加入10 μL CCK-8 試劑，培養2 h 后在免疫酶標檢測儀波長450 nm 處檢測各孔的D450nm值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5.3 FCM 法檢測細胞凋亡率

取轉染48 h 后處于對數生長期的細胞，用500 μL 預冷的1×結合緩沖液將細胞制成1×106個/mL 的懸液。隨后加入5 μL 異硫氰酸熒光素標記的Annexin Ⅴ，混勻后孵育10 min；再加入2.5 μL PI，孵育5min。最后上流式細胞儀檢測凋亡率。

1.5.4 Transwell 小室實驗檢測細胞的侵襲能力

首先在Transwell 小室上室中鋪設基質膠，隨后將各組對數生長期細胞接種于Transwell 小室24 孔板，以2×105個/mL 的密度將細胞加入上室（每孔100 μL），下室中加入含胎牛血清的培養液（250 μL/孔）。培養48 h 后取出小室，用棉簽拭去微孔膜上室的細胞。用PBS 沖洗小室上下面2 遍，隨后用多聚甲醛溶液固定黏附于下室微孔膜下面的細胞，再用結晶紫染色15 min，干燥后在光學顯微鏡下觀察細胞形態（放大倍數為400 倍），并隨機取3～5 個視野進行計數。

1.5.5 細胞劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力

取轉染48 h 后處于對數生長期細胞，以5×104個/孔密度接種于6 孔板中，當細胞融合度達90%～100%時用無菌槍頭進行劃痕處理。首先吸去原培養液，然后用PBS 洗滌3 次，置于無血清培養液中繼續培養24 h。在0 和24 h 時在光學顯微鏡下觀察劃痕的距離并拍照，劃痕愈合率（%）＝（0 h 劃痕寬度—24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%[10]。

1.6 雙熒光素酶報告基因驗證TP73-AS1、miR-181b 和HMGB1 基因間的靶向作用關系

采用雙熒光素酶報告基因驗證TP73-AS1 和miR-181b 間的靶向關系，將NC-mimics 和miR-181b-mimics 與構建獲得的TP73-AS1-野生型（wild type，WT）（將TP73-AS1 針對候選靶基因miR-181b 3’-UTR 的靶序列插入到攜帶有熒光素有酶報告基因的載體中）和TP73-AS1-突變型（mutant type，MUT）（將突變后TP73-AS1針對候選靶基因miR-181b 3’-UTR 的靶序列插入到攜帶有熒光素有酶報告基因的載體中）兩兩組合后轉入A549 細胞中，48 h 后檢測各組細胞的熒光素酶活性。在A549 和NCI-H1299 細胞中分別轉入shTP73-AS1 及其對照shNC，隨后采用實時熒光定量PCR 檢測miR-181b 的表達水平；實驗流程同1.4 節。

采用雙熒光素酶報告基因驗證miR-181b和HMGB1 基因間的靶向關系，將NC-mimics和miR-181b-mimics 與構建獲得的HMGB1 基因-WT（將HMGB1 基因針對候選靶基因miR-181b 3’-UTR 的靶序列插入到攜帶有熒光素有酶報告基因的載體中）和HMGB1-MUT（將突變后的HMGB1 基因針對候選靶基因miR-181b 3’-UTR 的靶序列插入到攜帶有熒光素有酶報告基因的載體中）兩兩組合后轉入A549 細胞中，48 h 后檢測各組細胞的熒光素酶活性。在A549 和NCI-H1299 細胞中分別轉入miR-181binhibitor 及其對照NC-inhibitor，隨后采用實時熒光定量PCR檢測HMGB1 mRNA的表達水平；實驗流程同1.4 節。

1.7 TP73-AS1 通 過miR-181b/HMGB1 軸對細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

取A549 和NCI-H1299 細胞，實驗分為4組：NC 組（不進行轉染）、shTP73-AS1 組（僅轉 入shRNA-TP73-AS1）、TP73-AS1 shRNA ＋miR-181b-inhibitor 組（同時轉染shRNA-TP73-AS1 和miR-181b-inhibitor）、shRNA-TP73-AS1 ＋HMGB1 組（同時轉染shRNA-TP73-AS1 和過表達重組載體pcDNA-HMGB1）。轉染步驟同1.5.1 節。

收集轉染48 h 后的各組細胞，采用實時熒光定量PCR 法檢測細胞中HMGB1 mRNA 的表達水平，檢測流程同1.4 節。采用蛋白印跡法檢測細胞中HMGB1 蛋白的表達水平：收集轉染48 h后的各組細胞，用RAPI 裂解液提取總蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，行10% SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理2 h，加入一抗[兔抗人HMGB1 和GAPDH（內參照）單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）]4 ℃孵育過夜；次日除去一抗，用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶500）]處理1 h。最后用電化學發光試劑顯影后對蛋白條帶進行成像處理，用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值。

收集轉染48 h 后處于對數生長期的細胞，再分別采用CCK-8 法（檢測流程同1.5.2 節）、FCM 法（檢測流程同1.5.3 節）、Transwell 小室法（檢測流程同1.5.4 節）和細胞劃痕愈合實驗（檢測流程同1.5.5 節）檢測細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移能力。

1.8 統計學方法

Fig.1 The expression level of long non-coding RNA (LncRNA) TP73-AS1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.A:Expression level of TP73-AS1 in cancer and adjacent tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.**P＜0.01;B:Correlation analysis of TP73-AS1 and miR-181b in cancer tissue;C:The overall survival rate curve of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients with TP73-AS1 high expression or low expression was analysis by Kaplan-Merier method;D:The expression level of TP73-AS1 in human normal lung epithelial BEAS-2B cells and NSCLC A549 and NCI-H1299 cells was detected real-time fluorescence quantitative PCR .**P＜0.01,vs BEAS-2B cells (n=5).圖1 實時熒光定量PCR 法檢測LncRNA TP73-AS1 在NSCLC 組織和細胞（A549 和NCI-H1299）中的表達水平并分析與miR-181b 的相關性

本研究中各項實驗均獨立重復5 次。采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料表示，2 組間比較用t檢驗或配對t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組內兩兩比較用LSD-t檢驗；2 組重復測量數據的比較用重復測量方差分析；生存分析采用log-rank 檢驗；相關性采用Pearson 相關性分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP73-AS1 在NSCLC 組織和細胞中的表達

實時熒光定量PCR 檢測結果（圖1A）提示，癌組織中TP73-AS1 的相對表達量為2.14±0.82，明顯高于癌旁組織中的1.16±0.41，差異有統計學意義（P＜0.01）。癌組織中miR-181b的相對表達量為0.66±0.25，miR-181b 與TP73-AS1 的表達呈負相關（r＝－0.623，P＜0.001，圖1B）。以TP73-AS1 的中位表達量1.95 為臨界值，將患者分為高表達組和低表達組，各為21 例。高表達組患者的總生存率明顯低于低表達組（P＝0.032，log-rank 檢驗，圖1C）。

采用實時熒光定量PCR 檢測人正常肺上皮細 胞BEAS-2B 和NSCLC A549 和NCI-H1299細胞中TP73-AS1 的表達水平。結果（圖1D）顯示，A549 和NCI-H1299 細胞TP73-AS1 的相對表達量分別為3.23±0.64 和2.86±0.77，均明顯高于正常肺上皮BEAS-2B 細胞的1.01±0.21，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 敲減TP73-AS1 表達對NSCLC 細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

Fig.2 The effect of long non-coding RNA (LncRNA) TP73-AS1 knockdown on the proliferation of nonsmall cell lung cancer (NSCLC) A549 and NCI-H1299 cells.A:The expression level of TP73-AS1 in A549 and NCI-H1299 cells transfected with shRNA-TP73-AS1 (shTP73-AS1) or shRNA-negatice control(shNC) (as the control) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR;B:The effect of TP73-AS1 knockdown on the proliferation of A549 and NCI-H1299 cells.*P＜0.05,**P＜0.01,vs shNC group (n=5).圖2 采用實時熒光定量PCR 法檢測轉入shTP73-AS1 對A549 和NCI-H1299 細胞中TP73-AS1 表達水平的影響（A），以及敲除TP73-AS1 表達對A549 和NCI-H1299 細胞增殖的影響（B）

實時熒光定量PCR 檢測結果（圖2A）顯示，與shNC 組相比，轉入shTP73-AS1 后A549 和NCI-H1299 細胞TP73-AS1 表達水平明顯降低（P值均＜0.01）。A549 細胞中TP73-AS1 的表達量從1.02±0.21 下調至0.21±0.10，NCI-H1299 細胞中TP73-AS1 的表達量從1.13±0.25 下調至0.19±0.11。

CCK-8 法檢測結果（圖2B）顯 示，敲降TP73-AS1 表達可以明顯抑制A549 和NCI-H1299 細胞的增殖活力（P值均＜0.05）。A549 細胞培養至第96 h 時，shRNA-NC 組和shTP73-AS1 組細胞的D450nm值分別為2.67±0.10 和1.23±0.09，而NCI-H1299 細胞分別為1.92±0.07 和1.13±0.07。

Fig.3 Effect of long non-coding RNA (LncRNA) TP73-AS1 knockdown on invasion (A,crystal violet staining,×100),migration (B,×100) and apoptosis rate (C) of A549 and NCI-H1299 cells transfected with shRNA-TP73-AS1 (shTP73-AS1) were detected by Transwell,Wound healing and FCM methods.A549 and NCI-H1299 cells were transfected with shRNA-negative control (shNC) as the control.**P＜0.01,vs shNC group (n=5).圖3 敲除TP73-AS1 表達對A549 和NCI-H1299 細胞侵襲（A）、遷移（B）和凋亡率（C）的影響

Transwell 小室法和劃痕愈合實驗檢測結果（圖3A 和圖3B）顯示，A549 細胞中shNC 組發生侵襲的細胞數為（189.32±65.02）個，遷移率為（42.12±11.03）%，均高于shTP73-AS1 組的（82.03±20.11）個 和（18.25±6.11）%（P值均＜0.01）；NCI-H1299 細胞中shNC 組發生侵襲的細胞數為（178.32±46.92）個，遷移率為（59.87±12.78）%，均高于shTP73-AS1 組的（71.00±24.63）個 和（35.65±11.34）%（P值均＜0.01）。敲降TP73-AS1 可以明顯抑制A549和NCI-H1299 細胞的侵襲和遷移能力。

FCM 法檢測結果（圖3C）顯示，A549 細胞和NCI-H1299 細胞shNC 組的凋亡率分別為（7.11±1.05）% 和（11.02±1.34）%，均 低于shTP73-AS1組 的（23.05±6.34）% 和（26.98±4.32）%（P值均＜0.01）。這一結果提示，敲低TP73-AS1 表達可以明顯促進A549 和NCI-H1299 細胞的凋亡。

2.3 TP73-AS1 靶向調控miR-181b 進而介導HMGB1 在NSCLC 細胞中的表達

用Starbase 軟件預測到miR-181b 可能是TP73-AS1 的靶基因（圖4A）。雙熒光素酶報告基因實驗結果（圖4B）顯示，miR-181b-mimics ＋TP73-AS1-WT 可使熒光素酶活性下降（P＜0.01）。實時熒光定量PCR 檢測結果（圖4C）顯示，A549 和NCI-H1299 細胞中敲低TP73-AS1 表達后，miR-181b 的表達水平均被明顯上調（P值均＜0.01）。上述結果提示，miR-181b 是TP73-AS1 的靶基因。

用TargetScan 在線工具預測到HMGB1 是miR-181b 的候選靶基因（圖4D）。雙熒光素酶報告基因實驗結果（圖4E）顯示，miR-181bmimics ＋HMGB1-WT 使熒光素酶活性下降（P＜0.01）。實時熒光定量PCR 檢測結果（圖4F）顯示，A549 和NCI-H1299 細胞中敲低miR-181b 表達后，HMGB1 mRNA 的表達水平均明顯上調（P值均＜0.01）。癌組織中miR-181b與HMGB1 mRNA的表達呈負相關（r＝－0.697，P＜0.01）。以上結果提示，HMGB1 是miR-181b 的靶基因。

Fig.4 Analysis of targeted regulatory relationship between TP73-AS1 and miR-181b/high mobility group box-1 (HMGB1).A:The bioinformatics analysis result showed that TP73-AS1 had a binding site with miR-181b;B:Dual-luciferase reporter gene assay was used to analyse the relationship between TP73-AS1 and miR-181b;C:The expression level of miR-181b in A549and NCI-H1299 cells transfected with shRNA-TP73-AS1 (shTP73-AS1) or shRNA-negatice control (shNC) (as the control) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR;D:The bioinformatics analysis result showed that miR-181b had a binding site with HMGB1;E:Dual-luciferase reporter gene assay was used to analyse the relationship between HMGB1 and miR-181b;F:The expressionlevelof HMGB1 mRNA in A549and NCI-H1299cells transfected with miR-181b-inhibitor or NC-inhibitor(asthe control) wasdetectedby real-time fluorescencequantitative PCR.**P＜0.01,vs the controlgroups.圖4 采用雙熒光素酶報告基因驗證TP73-AS1 與miR-181b，以及miR-181b 與HMGB1 基因間的的靶向調控關系

2.4 敲降TP73-AS1 通過上調miR-181b/HMGB1軸對NSCLC 細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

實時熒光定量PCR（圖5A）和蛋白質印跡法（圖5B）檢測結果顯示，與對照組相比，敲低TP73-AS1 表達后可以明顯抑制A549 和NCI-H1299 細胞中HMGB1 mRNA 和蛋白的表達水平（P值均＜0.01）。同時，轉染shTP73-AS1 ＋miR-181b-inhibitor 或 者shTP73-AS1 ＋HMGB1 過表達重組載體后，HMGB1 mRNA 和蛋白的表達水平均較shTP73-AS1 組明顯上調（P值均＜0.01）。

Fig.5 The expression level of high-mobility group box-1 (HMGB1) mRNA (A) and protein (B) in A549 cells and NCI-H1299 cells transfected with shRNA-TP73-AS1 (shTP73-AS1),shTP73-AS1+miR-181b-inhibitor or shTP73-AS1+pcDNA-HMGB1 (HMGB1 overexpression recombinant vector) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.A549 and NCI-H1299 cells were transfected with shRNAnegative control (shNC) as the control.**P＜0.01,vs shNC group;△P＜0.05,△△P＜0.01,vs shTP73-AS1 group (n=5).圖5 實時熒光定量PCR 法（A）及蛋白質印跡法（B）檢測敲低TP73-AS 表達后再沉默miR-181b 表達或使HMGB1 過表達對A549 和NCI-H1299 細胞中HMGB1 mRNA 和蛋白表達水平的影響

CCK-8 法（圖6A）、FCM 法（圖6B）、Transwell小室實驗（圖6C）及劃痕愈合實驗（圖6D）檢測結果顯示，敲低TP73-AS1 可明顯抑制A549和NCI-H1299 細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并促進細胞凋亡（P值均＜0.05）。在A549 細胞中，shTP73-AS1 組轉染后96 h 時D450nm值為0.98±0.05、侵襲細胞數為（76.25±23.01）個、細胞遷移率為（20.12±6.32）%、細胞凋亡率為（29.36±6.32）%；shTP73-AS1 ＋miR-181binhibitor 組D450nm值為1.67±0.06、侵襲細胞數為（175.26±34.01）個、細胞遷移率為（51.02±7.23）%和細胞凋亡率為（20.01±3.33）%，shTP73-AS1 ＋HMGB1 組D450nm值為1.83±0.05、侵襲細胞數為（170.69±27.91）個、細胞遷移率為（49.85±8.69）%和細胞凋亡率為（19.36±4.21）%。在NCI-H1299 細胞中shTP73-AS1 組轉染后96 h時D450nm值為0.84±0.05、侵襲細胞數為（70.36±24.12）個、細胞遷移率為（18.36±9.34）% 和細胞凋亡率為（26.34±5.01）%，shTP73-AS1 ＋miR-181b-inhibitor 組D450nm值 為1.48±0.07、侵襲細胞數為（165.32±38.04）個、細胞遷移率為（51.36±6.85）% 和細胞凋亡率為（15.32±2.85）%，shTP73-AS1 ＋HMGB1 組D450nm值為1.36±0.05、侵襲細胞數為（170.39±44.28）個、細胞遷移率為（53.34±7.36）%和細胞凋亡率為（16.35±3.87）%。同時敲降miR-181b 或過表達HMGB1 則下調了敲降TP73-AS1 對A549 細胞和NCI-H1299 細胞的抑制作用（P＜0.05）。以上結果說明，敲降TP73-AS1 可通過上調miR-181b/HMGB1 軸抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進凋亡。

Fig.6 The cell proliferation (A),apoptosis rate (B),invasion (C) and migration (D) abilities of A549 and NCI-H1299 cells transfected with shRNA-TP73-AS1 (shTP73-AS1),shTP73-AS1+miR-181b-inhibitor or shTP73-AS1+pcDNA-HMGB1 (HMGB1 overexpression recombinant vector) were detected by CCK-8 method,FCM method,Transwell experiment (crystal violet staining,×400) and scratch healing experiment.A549 and NCI-H1299 cells were transfected with shRNA-negative control (shNC) as the control.**P＜0.01,vs shNC group;△△P＜0.01,vs shTP73-AS1 group (n=5).圖6 CCK-8 法（A）、FCM 法（B）、Transwell 小室實驗（C）和劃痕愈合實驗（D）檢測敲低TP73-AS1 表達后再沉默miR-181b 表達或使HMGB1 過表達對A549 和NCI-H1299 細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的的影響

3 討論

LncRNA 可以通過多種途徑在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[11]。LncRNA 可作為一種競爭性內源性RNA 與miRNA 相互作用，參與靶基因的表達調控；反之，miRNA 可通過RNA誘導沉默復合物調控lncRNA 發揮生物學功能[8]。TP73-AS1 也被稱為KIAA0495，位 于1p36 染色體上[12]。本研究發現，TP73-AS1 可以調控miR-181b/HMGB1 軸，進而影響NSCLC 細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡。

既往研究發現，TP73-AS1 在多種癌（膀胱癌、結直腸癌和乳腺癌）組織中表達水平升高，其可能通過Wnt/β-連環蛋白、晚期糖基化終產物受體信號通路和上皮-間質轉化相關信號通路等促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[12]。TP73-AS1在NSCLC 中的表達及意義既往少有報道。本研究發現，TP73-AS1 在NSCLC 癌組織和細胞中表達上調。TP73-AS1 與癌癥患者的預后密切相關，ZHU 等[13]發 現，與NSCLC 組 織TP73-AS1 低表達患者相比，高表達患者的總體生存率較低，本研究結果與之一致。TP73-AS1 與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關[12]。本研究結果顯示，敲低TP73-AS1 表達可以明顯抑制A549 和NCI-H1299 細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并促進細胞凋亡。以上結果提示，TP73-AS1 在NSCLC 中可能發促癌基因作用。

TP73-AS1 可通過調控miRNA 信號通路影響腫瘤細胞的生物學行為，如TP73-AS1 可以靶向miR-194-5p 調控SDAD1 基因的表達，促進胃癌細胞的增殖和轉移[14]；靶向miR-490-3p 調控TWIST1 基因的表達，促進三陰性乳腺癌組織中血管生成[6]。本研究中，采用生物信息學技術和雙熒光素酶基因報告檢測系統證實了TP73-AS1 與miR-181b 間的靶向關系。

既往研究發現，miR-181b 在NSCLC 癌組織和細胞中表達下調，發揮抑癌基因的作用；miR-181b 與NSCLC 發生、發展和患者預后密切相關[9,15]。HMGB1 是miR-181b 的靶基因，本研究中通過生物信息學技術和雙熒光素酶基因報告系統證實了miR-181b 與HMGB1 基因的靶向調控關系。HMGB1 作為NSCLC 可能的生物學標志物已得到廣泛研究，HMGB1 與NSCLC 患者的臨床分期、組織分化程度、病理類型、淋巴結轉移和耐藥密切相關[16-17]。LIU等[18]發現，miR-181b 可以靶向調控HMGB1，上調miR-181b 表達可以抑制NSCLC 細胞的增殖和侵襲。

為了進一步證實TP73-AS1 通過miR-181b/HMGB1 軸在NSCLC 中的作用，本研究對A549 和NCI-H1299 細胞分別僅轉染shTP73-AS1、同時轉染shTP73-AS1 ＋miR-181binhibitor、同時轉染shTP73-AS1 ＋HMGB1 過表達載體，結果顯示轉染shTP73-AS1 ＋miR-181b-inhibitor 或 者shTP73-AS1 ＋HMGB1 過表達載體后，HMGB1 mRNA 和蛋白的表達水平較僅轉染shTP73-AS1 明顯上調，細胞增殖、侵襲和遷移能力也明顯升高，而凋亡水平明顯下降。這一結果提示，TP73-AS1 可通過調控miR-181b/HMGB1 軸促進癌細胞增殖、侵襲、遷移，并促進細胞凋亡。既往也有研究發現，HMGB1與腫瘤細胞周期、上皮-間質轉化、自噬和耐藥等密切相關[19-22]，但本研究未對此進行分析，需要未來深入探討。

綜上所述，TP73-AS1在NSCLC組織和細胞中高表達，可通過調控miR-181b/HMGB1軸促進癌細胞增殖、侵襲、遷移，并促進細胞凋亡。TP73-AS1有望為臨床上治療NSCLC提供一個潛在靶點，TP73-AS1在外周血中的表達及意義是本課題組今后研究的重點。