錯配修復基因hMSH2表達水平與上皮性卵巢癌患者的臨床預后相關

滑 天 ，李 琰，李曉飛，孫海燕，陳 娟，康 山

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖道常見的惡性腫瘤，死亡率占各類婦科腫瘤的首位[1]。由于缺乏早期癥狀，超過2/3患者確診時已屬晚期，5年生存率不超過40%[2]。腫瘤減滅術和以鉑類為基礎的化療是晚期卵巢癌治療的標準策略。然而，鉑類耐藥已經成為影響卵巢癌患者預后的重要因素。

鉑類耐藥是一個受多因素影響的復雜過程，其中個體DNA修復能力的改變是鉑類耐藥的重要分子基礎。錯配修復（mismatch repair，MMR）的主要功能包括維持基因組穩定性及保真性，并且參與化療藥物誘導DNA損傷應答，在腫瘤的發生及發展中發揮著重要的作用[3]。錯配修復酶人類MutS同系物2（human MutS homolog 2，hMSH2）是MMR系統的核心基因[4]。早期研究表明，hMSH2基因缺陷或丟失與卵巢癌發生和對鉑類藥物的反應均具有密切的關系[5-6]。然而，有關hMSH2表達與EOC患者預后之間的關系仍不明確。本研究通過分析EOC組織中hMSH2 mRNA表達水平與患者臨床病理特征及臨床預后的關系，旨在探討hMSH2表達是否能夠成為EOC患者預后判斷的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取河北醫科大學第四醫院2011年11月—2015年6月收治的150例EOC患者作為研究對象。病例納入標準：（1）初治病例；（2）術前未進行任何治療（新輔助化療、生物治療和放射治療等）；（3）手術方式采取規范的全面分期手術；（4）術后給予規范靜脈化療（紫杉醇聯合順鉑或聯合卡鉑）；（5）具有完整的臨床資料；（6）具備隨訪條件。病例排除標準：（1）非初治病例；（2）術前給予其他治療（新輔助化療、生物治療和放射治療等）；（3）手術方式不規范；（4）術后未給予規范化療；（5）臨床資料不完整；（6）轉移性卵巢癌；（7）合并其他部位腫瘤。

患者年齡20～78歲，中位年齡56歲。按照國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期標準：Ⅰ期19例（12.66%），Ⅱ期9例（6.00%），Ⅲ期112例（74.67%），Ⅳ期10例（6.63%）。按照WHO分類法組織學類型：漿液性腺癌90例（60.00%），宮內膜樣癌41例（27.33%），黏液性癌13例（8.67%），透明細胞癌6例（4.00%）。組織病理分級：高分化38例（25.33%），中分化67例（44.67%），低分化45例（30.00%）。術后輔助化療情況：采用紫杉醇聯合順鉑（靜脈注射）方案者31例（20.71%），紫杉醇聯合卡鉑（靜脈注射）方案者119例（79.39%）；化療完成3～4個療程者21例（14.00%），6～8個療程者97例（64.67%），8～10個療程者32例（21.33%）。

術中獲取組織標本，離體后迅速儲存至RNA-later溶液中，4 ℃條件下處理過夜，隨后置于－20 ℃冰箱保存以備提取RNA。本研究獲得患者知情同意并通過河北醫科大學第四醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器

TRIzol購自北京索萊寶生物有限公司；PCR引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自德國Qiagen公司。鼠抗人hMSH2單克隆抗體（EPR3943，ab92473）購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔鼠通用IgG、DAB修復液及SP免疫組織化學檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

PCR儀（Mx3005P）為美國Bio-Rad公司產品，光學顯微鏡為德國蔡司公司產品。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測EOC組織中hMSH2 mRNA的表達水平

按照TRIzol試劑說明書提取步驟提取150例EOC患者癌組織標本中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書提供的操作步驟將提取的總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增；以GAPDH基因作為內參照，引物序列見表1。PCR擴增條件：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。采用SYBR染料實時監測擴增產物的含量，實驗重復3次。以公式2－ΔCt計算hMSH2基因的相對表達量，ΔCt＝CthMSH2－CtGAPDH。

1.4 免疫組織化學法檢測EOC組織中hMSH2蛋白的表達水平

從河北醫科大學第四醫院病理科收集上述150例中的86例EOC組織蠟塊，進行切片（厚度為4 μm）并行HE染色。按照SP檢測試劑盒說明書提供的步驟進行免疫組織化學法檢測，一抗為鼠抗人hMSH2單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶2 000）。用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。結果判定，采取雙盲方式評價染色結果。每張切片選擇5個高倍鏡下視野（放大倍數為200倍），分別按照陽色細胞所占百分比和染色強度計分。hMSH2蛋白以細胞核內呈現棕黃色顆粒為陽性顯色，按陽性細胞所占百分比進行計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞所占百分比＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，＞81%為4分；按細胞著色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。2項評分相乘≥4分定義為hMSH2蛋白高表達，＜4分定義為hMSH2蛋白低表達[7]。

表1 hMSH2及GAPDH基因引物序列Table 1 The primer sequences of human MutS homolog 2 (hMSH2) and GAPDH genes

1.5 隨訪資料

所有研究對象均于手術后開始規律隨訪，采用門診隨訪及電話隨訪，平均4～6個月1次。隨訪截止日期為2018年6月1日。預后評價指標為總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progression free survival，PFS）。OS是指以手術日期至死亡或隨訪截止日期計算，PFS是指以手術日期至疾病進展日期計算。中途失訪者12例，終止時間為最后1次隨訪時間，均納入生存分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件對獲得研究數據進行統計學分析。hMSH2表達與EOC患者臨床病理參數之間的相關性分析用χ2檢驗；Wilcoxon秩和檢驗比較鉑耐藥組患者和鉑敏感組患者腫瘤組織中hMSH2 mRNA表達水平的差異；Kaplan-Meier法進行單因素分析單變量分析，用log-rank檢驗生存率差異，GraphPad 5繪制生存曲線。多因素分析采用COX回歸模型進一步分析預后相關因素。采用Spearman相關性分析hMSH2 mRNA和蛋白表達的相關性。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hMSH2 mRNA在EOC患者癌組織中的表達水平

采用實時熒光定量PCR法檢測150例EOC患者腫瘤組織中hMSH2 mRNA的表達水平。結果（圖1）顯示，hMSH2 mRNA相對表達量的中位值為0.024 8。

2.2 hMSH2蛋白在EOC患者癌組織中的表達水平

采用免疫組織化學法檢測86例EOC患者腫瘤組織中hMSH2蛋白的表達水平。結果顯示，hMSH2蛋白定位于細胞核內。hMSH2蛋白陽性表達率為90.69%，陰性表達率為9.31%。hMSH2蛋白在EOC腫瘤組織中的表達見圖2。

Fig.1 The expression level of human MutS homolog 2 (hMSH2) mRNA in the tumor tissues of 150 patients with epithelial ovarian cancer (EOC) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.圖1 實時熒光定量PCR法檢測150例患者EOC組織中hMSH2 mRNA的表達水平

2.3 hMSH2 mRNA與蛋白表達之間的關系

采用Spearman分析hMSH2 mRNA表達水平與蛋白表達水平的相關性。結果顯示，hMSH2 mRNA表達水平與蛋白表達呈正相關（P＝0.024，r＝0.517）。

2.4 hMSH2 mRNA表達與EOC患者臨床病理特征的關系

依據hMSH2 mRNA表達水平的中位值將150例EOC患者分為高表達組和低表達組。結果（表2）顯示，hMSH2 mRNA表達水平與臨床分期、腫瘤組織學分級以及淋巴結轉移密切相關（P值均＜0.05），而與EOC患者年齡、腫瘤病理學類型、腫物大小及是否存在腹腔積液無關（P值均＞0.05）。此外，χ2趨勢性檢驗表明，hMSH2 mRNA表達水平存在隨著腫瘤組織學分級升高而逐漸下降的趨勢。

2.5 hMSH2 mRNA表達水平與EOC患者鉑類藥物耐藥的關系

Fig.2 The hematoxylin-eosin (HE) staining of epithelial ovarian cancer (EOC) tissue;the expression of human MutS homolog 2 (hMSH2) protein in EOC tissues was detected by immunohistochemistry (DAB staining,×200,×400).圖2 EOC組織的HE染色結果以及免疫組織化學法檢測hMSH2蛋白在EOC組織中的表達情況（DAB，×200和×400）

表2 hMSH2 mRNA表達與EOC患者臨床病理特征的關系Table 2 Correlations between the human MutS homolog 2 (hMSH2) mRNA and clinicopathological factors of epithelial ovarian cancer patientsn (%)

依據2011年婦科腫瘤協作組（Gynecologic Cancer Inter Group，GCIC）[8]提出的根據無鉑間期（platinum-free interval，PFI），即最后一次含鉑治療后的PFS時間，將患者人群分為鉑耐藥組（最后一次含鉑化療后1～6個月即出現進展的患者）和鉑敏感組（最后一次含鉑化療后6～12個月時出現進展的患者）。將150例研究對象分為鉑類耐藥組（60例）和鉑類敏感組（90例），實時熒光定量PCR檢測結果（圖3）顯示，鉑耐藥組中hMSH2 mRNA的表達水平明顯低于鉑敏感組，差異具有統計學意義（P＝0.002）。

2.6 hMSH2 mRNA表達水平與EOC患者臨床預后的關系

本研究對150例EOC患者進行了隨訪，隨訪率為92%。以hMSH2 mRNA相對表達量的中位值設置為臨界值，將150例EOC患者分為hMSH2 mRNA高表達組（75例）及低表達組（75例）。采用Log-rank檢驗和Kaplan-Meier分析方法計算hMSH2 mRNA表達水平對患者PFS及OS的影響。Log-rank檢驗結果（圖4）顯示，hMSH2 mRNA低表達患者的PFS明顯低于高表達組（P＝0.011），hMSH2 mRNA低表達組患者OS明顯低于高表達組患者（P＝0.007）。

單因素分析結果（表3）顯示，FIGO分期、初次手術殘留病灶大小及hMSH2 mRNA表達水平均與EOC患者預后相關（P＜0.05）。將FIGO分期、手術殘余病灶大小及hMSH2 mRNA表達水平納入COX回歸模型，結果顯示hMSH2 mRNA表達是預測EOC患者生存時間的獨立危險因素[風險比（hazard ratio，HR）＝1.91，95%可信區間（confidence interval，CI）為1.85～2.31，P＝0.033]。以上結果提示hMSH2 mRNA低表達可能與EOC患者的不良預后相關。

Fig.3 The comparison of human MutS homolog 2 (hMSH2) mRNA expression level between platinumresistant epithelial ovarian cancer (EOC) tissues and platinum-sensitive EOC tissues.**P＜0.01.圖3 EOC鉑類耐藥和鉑類敏感患者癌組織中hMSH2 mRNA表達水平的比較

Fig.4 Kaplan-meier analysis of the relationship between human MutS homolog 2 (hMSH2) mRNA expression level and progression free survival (PFS) and overall survival (OS) in epithelial ovarian cancer(EOC) patients.圖4 Kaplan-Meier分析hMSH2 mRNA表達與EOC患者PFS以及OS的關系

表3 影響EOC預后的單因素分析結果Table 3 Univariate analysis of prognosis in patients with epithelial ovarian cancer (EOC)

3 討論

目前，晚期EOC的標準治療方案是腫瘤減滅術和以鉑類藥物為主的輔助化療。盡管大多數患者對最初的治療有應答，但70%的患者最終會出現復發，且產生鉑類耐藥。鉑類藥物的作用機制是與腫瘤細胞的DNA形成pt-DNA加合物，從而介導腫瘤細胞壞死或凋亡。既往的研究表明，hMSH2在鉑類抗腫瘤藥物機制中起著重要作用。在鉑類化合物進入腫瘤細胞后與DNA形成pt-DNA加合物時hMSH2與hMSH6形成復合體識別其加合物，繼而招募凋亡相關蛋白激活凋亡通路，引發腫瘤細胞凋亡[9-10]。hMSH2功能缺陷將直接影響細胞識別DNA損傷和激活凋亡的能力，腫瘤細胞將忽略鉑類藥物導致的DNA損傷而繼續進行DNA復制，使得藥物失去誘導細胞凋亡的作用，發生耐藥[11]。舒丹等[12]在體外研究中均發現，在卵巢癌順鉑耐藥細胞株中hMSH2表達明顯下調。本實驗在臨床樣本中同樣證實，鉑耐藥患者腫瘤組織與鉑敏感腫瘤組織相比，hMSH2 mRNA呈現明顯的低表達狀態。上述結果提示，hMSH2基因的表達缺陷可能與卵巢癌患者的鉑類耐藥相關。

本研究中進一步采用生存分析模型探討了150例EOC癌組織中hMSH2 mRNA表達水平與患者臨床預后的關系。結果表明，hMSH2低表達的患者PFS和OS期均明顯縮短。既往研究顯示hMSH2表達在卵巢癌患者中的預后意義并不明確。一項納入102例EOC患者的研究表明，癌組織中hMSH2蛋白陽性表達是提示卵巢癌患者預后良好的指標[13]。然而，SAMIMI等[14]分析了54例卵巢癌組織hMSH2蛋白的表達，發現其與患者生存之間沒有明顯關聯。本研究結果顯示，hMSH2表達下降促使鉑類耐藥發生可能是導致EOC不良臨床結局的原因之一。在膀胱癌的研究中指出對于接受鉑類藥物治療的患者，hMSH2低蛋白與較低的存活率相關，在未接受化療的患者中hMSH2蛋白水平與生存之間并無關聯[15]。因此，hMSH2表達在未進行鉑化療患者中是否具有一致的預后意義仍需要進一步的研究。此外，本研究發現EOC患者癌組織中hMSH2 mRNA表達水平隨著FIGO分期增高表達量而下降，隨著腫瘤組織學分級增加而下降，伴有淋巴結轉移的患者表達量低于未轉移者，均表明hMSH2表達下調可能與EOC患者不良的臨床結局相關。

綜上所述，hMSH2 mRNA表達下降與患者鉑耐藥以及不良預后密切相關，而且hMSH2 mRNA表達是預測EOC患者OS的獨立危險因素。基于既往研究中不一致的結論，本研究結果可能有助于闡明一些先前的矛盾意見，但仍需要將來多中心研究進一步驗證。此外，hMSH2 mRNA表達水平與FIGO分期、腫瘤組織學分級和淋巴結轉移具有密切相關性，間接證實hMSH2 mRNA低表達對于患者不良臨床結局的預測價值。