C-Myc/Bcl-2蛋白雙表達彌漫大B細胞淋巴瘤中C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排的檢測及臨床意義

許 娟，楊文秀，馮江龍，濮珍紅，楊 光，沈丹丹

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴 瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL），其生物學行為和臨床過程都表現出很大的異質性[1]。DLBCL的類型很多，最常見的是非特指的DLBCL。日常工作中最常用的Hans分型將DLBCL分為生發中心細胞型（germinal center B-cell like，GCB）和非生發中心細胞型（nongerminal center B-cell like，non-GCB）[2]，但 是這遠遠不能涵蓋大B細胞淋巴瘤的異質性。雙表達淋巴瘤（double-expression lymphoma，DEL）是指同時具有C-Myc和Bcl-2蛋白高表達（C-Myc陽性表達細胞所占百分比≥40%和Bcl-2陽性表達細胞所占百分比≥70%）的DLBCL。在2016年更新的WHO造血和淋巴組織腫瘤分類（第4版）中提出的高級別B細胞淋巴瘤（high-grade B-cell lymphoma，HGBL）的診斷中，其中一類就是具有C-Myc、Bcl-2和（或）Bcl-6基因重排這一遺傳學改變的大B細胞淋巴瘤，即雙打擊（double-hit lymphoma，DHL）或三打擊淋巴瘤（triple-hit lymphoma，THL）[3]。DHL/THL發病率不高，但其C-Myc和Bcl-2蛋白陽性表達率高達80%～90%[4]，多數屬于DEL，有研究認為，DHL和THL比DEL的臨床過程和預后更差。DEL對臨床上B細胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL）常用的治療方案R-CHOP[利妥昔單抗（rituximab）＋環磷酰胺（cyclophosphamide）＋多柔比星（adriamycin）＋長春新堿（oncovin）＋強的松（prednisone）]反應較差，容易復發成為難治性B細胞淋巴瘤[5]。目前，對于這類淋巴瘤的有效治療方法一直在探索研究中[6]。淋巴瘤的免疫表型和遺傳學特征與臨床預后及其治療反應密切相關[7]，故DEL遺傳學和免疫表型相關的研究是實施其個體化醫療的關鍵。不同的DEL病例C-Myc和Bcl-2雙表達的分子機制不盡相同，其生物學行為和遺傳學改變也有所差異，在DEL病例中探討C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因變化特點的研究尚鮮有報道。本研究擬通過免疫組織化學法檢測蛋白表達和熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）檢測基因斷裂情況，探討C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排在DEL中的發生及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例收集

收集2010年1月1日—2018年12月31日由貴州醫科大學附屬醫院病理科確診的DLBCL病例資料，從中篩選出39例C-Myc和Bcl-2蛋白雙表達病例納入研究。

納入標準為：臨床病理資料完整，石蠟包埋腫瘤組織充足，免疫組織化學檢測結果提示C-Myc和Bcl-2均為高表達者。排除標準：臨床病理資料欠缺，石蠟包埋組織材料過少，并發其他惡性腫瘤，免疫組織化學檢測結果提示C-Myc和Bcl-2表達水平不滿足DEL診斷標準者。本研究內容已獲得貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

抗C-Myc、Bcl-2、CD10、Bcl-6和多發性骨髓瘤癌基因1（multiple myeloma oncogene 1，MUM1）單克隆、羊抗小鼠和（或）兔IgG（二抗）[通用二步法試劑盒，小鼠和（或）兔增強聚合物法檢測系統]（PV-9001）、EDTA修復液、EB病毒編碼的小分子RNA（Epstein-Barr virus encode RNA，EBER）原位雜交檢測試劑盒及DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，抗p65抗體單克隆購自美國Cell Signaling Technology公司；FISH探針[C-Myc（8q24）、Bcl-2（18q21）和Bcl-6（3q27）基 因雙色分離探針]及DAPI染色劑購自廣州安必平醫藥科技有限公司。

光學顯微鏡DM6B和原位雜交儀（Thermobrite）均為德國Leica公司產品。

1.3 免疫組織化學法檢測C-Myc、Bcl-2和p65的表達情況

采用PV二步法，抗原修復采用高壓熱修復（C-Myc和Bcl-2使用EDTA修復液，p65、CD10、MUM1和Bcl-6使用檸檬酸鹽修復液），具體操作步驟按照PV-9001試劑盒操作說明進行。一抗為抗C-Myc和Bcl-2單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200）和抗p65單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 200）]。C-Myc、Bcl-2和p65檢測以本課題組既往檢測陽性病例檔案蠟塊作為陽性對照，用PBS代替一抗作為空白對照。

免疫組織化學檢測結果判定：以細胞核和細胞質出現淺黃色、棕黃色或棕褐色信號為陽性。C-Myc陽性信號位于細胞核上，Bcl-2陽性信號位于細胞質，p65陽性信號位于細胞核和細胞質（圖1）。隨機選擇10個不重復的視野（放大倍數為400倍），每個視野隨機計數400個腫瘤細胞中陽性細胞所占的比例，取10個視野的平均值作為該病例的表達率。參閱參考文獻[8]，C-Myc陽性細胞所占的比例≥40%為高表達，Bcl-2陽性細胞所占的比例≥70%為高表達，若C-Myc和Bcl-2均高表達則定義為C-Myc/Bcl-2雙表達的B細胞淋巴瘤；p65陽性細胞所占的比例≥20%為陽性表達[9]。

1.4 FISH檢測C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因的重排情況

Fig.1 The expressions of C-Myc,Bcl-2 and p65 proteins in diffuse large B cell lymphoma (DLBCL)patients with double expression of c-myc and Bcl-2 tissues were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×400).圖1 免疫組織化學法檢測DEL組織中C-Myc、Bcl-2及p65蛋白的表達情況（DAB，×400）

根據HE染色切片觀察選擇典型病變區域作為雜交區域。檢測嚴格按照試劑盒說明書步驟進行，簡述如下：切4 μm石蠟切片，65 ℃烘烤60 min，用二甲苯溶液脫蠟后，梯度乙醇溶液（100%→95%→85%→75%）復水；蒸餾水高壓噴氣后3 min，加入胃蛋白酶37 ℃消化25～40 min；用2×SSC溶液洗滌后，梯度乙醇溶液（75%→85%→95%→100%）脫水晾干，隨后避光加入6～10 μL探針[C-Myc（8q24）、Bcl-2（18q21）和Bcl-6（3q27）基因雙色分離探針]，85 ℃變性5 min，37 ℃雜交16～18 h；37 ℃條件下以2×SSC溶液、2×SSC/0.1% NP-40及75%乙醇溶液洗滌晾干后DAPI復染。圖像采集、分析和保存在FISH圖像分析軟件中完成。判讀標準：正常基因表現為2個紅色和綠色熒光融合的黃色信號；典型的基因斷裂信號類型是1個紅色、1個綠色和1個黃色信號。每個病例分析200個細胞，根據文獻出現1個紅色和1個綠色分離信號的腫瘤細胞＞10%確定為有重排[10]。

1.5 原位雜交法檢測EBER表達水平

實驗步驟簡述如下：切石蠟切片（厚度為4 μm），65 ℃烘烤60 min，二甲苯溶液脫蠟，無水乙醇水化，室溫風干，水浴箱37 ℃預熱濕盒加胃蛋白酶消化，去離子水洗后梯度乙醇溶液（75%→95%→100%）脫水，切片風干后滴加地高辛標記的EBER探針封閉過夜（37 ℃雜交儀中），滴加辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體37 ℃孵育30 min，DAB顯色及蘇木精染色后鹽酸分化，梯度乙醇溶液（75%→95%→100%）上行脫水風干加中性樹膠封片觀察結果。陽性判定：核表達陽性腫瘤細胞所占百分比≥10%認為是EBER陽性。

1.6 隨訪

通過住院病歷資料收集患者臨床相關數據，隨訪方式主要是電話咨詢，隨訪內容包括患者首次確診后的治療方案、生存及復發情況。以首次確診時間為隨訪開始時間，患者死亡或失訪結束隨訪，存活患者隨訪截止日期為2020年3月1日。39例DEL病例中獲訪33例，失訪6例，獲訪率84.62%（33/39）；其中存活24例，死亡9例。

1.7 統計學方法

用SPSS21.0軟件對實驗數據整理分析。計數資料組間比較采用Fisher精確檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制患者的總生存（overall survival，OS）時間曲線；生存曲線的比較采用對數秩檢驗（log-rank），采用COX比例風險回歸模型對預后進行多因素統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的臨床病理學特征

39例患者中男性20例，女性19例，男女比例為1.05∶1；中位年齡為64歲（范圍：28～79歲）；Hans分型：GCB型16例，non-GCB型23例；Ann Arbor分期：Ⅰ和Ⅱ期14例，Ⅲ和Ⅳ期25例；國際預后指數（international prognostic index，IPI）評 分：0～2分15例，3～5分24例；32例患者行乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測，＞245 U/L者17例，≤245 U/L者15例；原發部位：淋巴結內15例，淋巴結外24例；Ki-67表達：腫瘤細胞≥80%者26例，＜80%者13例。p65蛋白表達陽性21例（non-GCB 16例，GCB 5例），陰性18例（non-GCB 7例，GCB 11例）；p65在non-GCB亞型中高表達（P＝0.025，Fisher精確檢驗）。

2.2 FISH檢測結果

FISH檢測結果（圖2）顯 示，C-Myc及Bcl-2基因單獨重排者均為9例（9/39，23.08%），Bcl-6基因單獨重排者12例（12/39，30.77%），DHL和THL者5例（2例為C-Myc和Bcl-2基因重排，1例為C-Myc和Bcl-6基因重排，2例為C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排），檢出率為5/39（12.82%）（DHL及THL臨床病理資料見表1），Bcl-2和Bcl-6基因同時發生重排者3例。

2.3 幾種基因重排與DEL臨床病理學特征的關系

C-Myc、Bcl-2及Bcl-6基因重排與DEL臨床病理特征的關系見表2。C-Myc基因重排和HGBL與年齡有關，好發年齡＜60歲；Bcl-2和Bcl-6基因重排與免疫表型有關，好發于GCB型，差異有明顯的統計學意義。

2.4 生存分析結果

Fig.2 The C-Myc,Bcl-2 and Bcl-6 genes rearrangement in diffuse large B cell lymphoma (DLBCL)patients with double expression of C-Myc and Bcl-2 tissues were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) method (×1 000).圖2 FISH法檢測C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因的重排結果（×1 000）

表1 5例伴有C-Myc、Bcl-2和（或）Bcl-6基因重排DLBCL患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) with C-Myc、Bcl-2 and (or) Bcl-6 gene rearrangements

表2 4種基因重排對DEL臨床病理特征的影響Table 2 Effects of C-Myc,Bcl-2 and (or) Bcl-6 gene rearrangements on double-expression lymphoma(DEL) clinicopathological characteristics

39例DEL病例中獲訪33例，失訪6例，隨訪率為84.62%（33/39）；其中存活24例，死亡9例，中位存活時間為24.5個月。獲訪病例中診斷后接受R-CHOP方案治療者17例，RE-CHOP方案[R-CHOP＋依托泊苷（etoposide）]治療者5例，CHOP方案治療者4例，R-CHOP方案聯合自體干細胞移植者2例，CHOP方案聯合自體干細胞移植者1例，DAEPOCH方案[劑量調整（依托泊苷＋強的松＋長春新堿＋環磷酰胺＋多柔比星）]治療者1例，確診后未治療者4例，且經治療后復發者6例，其余病例治療方案不詳。基因重排與DEL患者生存狀況的關系見圖3，其中Bcl-6基因重排陽性組OS期低于陰性組，差異具有統計學意義（P＝0.037）。多因素COX回歸分析結果見表3。

Fig.3 Comparison of survival analysis between positive and negative double-expressing lymphoma gene rearrangement cases.A:C-Myc rearrangement positive vs negative cases (P=0.179);B:Bcl-2 rearrangement positive vs negative cases (P=0.087);C:Bcl-6 rearrangement positive vs negative cases (P=0.037);D:C-Myc,Bcl-2 and (or) Bcl-6 rearrangement positive vs negative cases (P=0.326).OS:Overall survival.圖3 Kaplan-Meier法分析C-Myc（A）、Bcl-2（B）和Bcl-6（C）基因重排以及HGBL（D）對DEL患者OS時間的影響

表3 DEL患者預后相關因素的多因素COX回歸分析Table 3 Multivariate COX regression analysis of prognostic factors related to diffuse large B cell lymphoma(DLBCL) patients with double expression of C-Myc and Bcl-2

3 討論

DLBCL的異質性體現在病因、臨床過程、預后、細胞來源、遺傳學特點和免疫表型等多個方面。其中，腫瘤細胞的遺傳學特征和免疫表型對DLBCL的臨床預后有重要影響。位于染色體8q24上的C-Myc基因、18q21上的Bcl-2和3q27上的Bcl-6是重要的轉錄因子或凋亡相關蛋白編碼基因[9]，其表達的蛋白參與細胞的分化、生長、增殖以及凋亡等重要過程，對于HGBL的DHL和（或）THL中所出現的C-Myc、Bcl-2或Bcl-6基因的重排對其臨床過程和預后、治療效果都有明顯影響，使其容易發展成為復發/難治性的大B細胞淋巴瘤。然而，臨床中DEL遠比DHL多見，雖然DEL的臨床過程和預后也較差。研究顯示，相當一部分DEL中存在NFκB的異常表達，后者與DLBCL的不良預后有關。因此，DEL中C-Myc、Bcl-2或Bcl-6基因重排等遺傳學改變對其發生和發展以及免疫表型的影響值得進一步予以探討。

本研究在對39例DEL的DLBCL患者的基因重排檢測中發現，C-Myc和Bcl-2基因重排檢出率均為23.08%（9/39），Bcl-6重排檢出率為30.77%（12/39）。與既往文獻報道相比[12-13]，本組DEL病例中C-Myc、Bcl-6和Bcl-2重排檢出率明顯高于其他非特指的DLBCL，尤其是DHL的檢出率（12.82%）明顯高于非特指的DLBCL。結果表明，C-Myc/Bcl-2雙表達對DHL和（或）THL的發現有初篩的意義，這與既往的報道一致。值得提出的是，本研究還發現在年齡＜60歲的DEL病例中，更容易發生C-Myc基因重排以及DHL和（或）THL；在本研究檢測出的5例DHL和（或）THL中，原發于扁桃和頭頸部者占大多數，并以GCB型DLBCL為主。這表明年齡＜60歲、原發扁桃和頸部的GCB型DEL對DHL和（或）THL診斷更有提示意義，對此類患者須進行C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排的檢測。

既往文獻報道及本課題組前期研究[14-15]都發現，DLBCL中存在與NF-κB活化相關的多種基因異常，故轉錄因子NF-κB異常活化是DLBCL的重要特征，其異常活化在non-GCB型DLBCL中尤其明顯。本研究檢測發現，39例DEL患者中p65（NF-κB最關鍵的組件之一）的陽性表達率為53.84%（21/39），21例陽性表達病例中non-GCB型16例，GCB型5例；在GCB和non-GCB型DEL病例中p65表達有明顯差異，p65在non-GCB亞型中顯示為高表達，這與本課題組在其他非特指DLBCL中的研究結果一致。p65表達在DHL和（或）THL病例中的陽性表達率為40%，低于其他的DEL病例（58.8%）；這一結果提示，在DHL和（或）THL病例中C-Myc和Bcl-2的表達與NF-κB活化可能無關，而是C-Myc和Bcl-2基因重排的結果，但2組間的p65表達水平未見差異有統計學意義，這可能與本研究中DHL和（或）THL的研究病例數少有關。p65在DEL中陽性表達率在50%以上，這說明半數以上的DEL病例都存在NF-κB的異常活化。由于C-Myc和Bcl-2都是NF-κB通路的下游分子，本研究提示在上述基因重排陽性和陰性的病例中C-Myc和Bcl-2的表達都可能與p65表達有關。NF-κB異常活化是DLBCL的重要特征，故在基因重排陰性的DEL中，2種蛋白高表達是否與NF-κB活化有關或是其他的分子機制還需要擴大研究范圍并采用多層次的研究方法進行深入探討。

DEL和DHL都有較差的臨床過程、治療反應和預后，這已經被既往的研究所證實。LDH、IPI、臨床分期、發生部位和年齡都與DLBCL的臨床發展和預后有關。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）與淋巴瘤發生和發展的相關性早有報道，其與免疫缺陷相關DLBCL的發生密切相關。本研究比較分析了39例DEL中不同基因重排情況，以及對患者部分臨床病理特征的影響，并分析了不同基因重排和一些臨床病理特征對患者生存狀況的影響。結果發現，39例DEL病例中，Bcl-2與Bcl-6基因重排發生與DEL的Hans分型有關，這與既往報道一致；GCB型DEL病例中Bcl-2基因發生重排者明顯多于non-GCB型患者，但Bcl-6基因重排也在GCB型DEL中多見的結果，這與其他研究報道不同[16]。造成這一結果的原因是客觀的地區差異，還是本研究中病例的偏差還有待于擴大研究樣本做進一步的研究。本研究中發現，C-Myc基因重排與DHL和（或）THL發生與DEL患者年齡的關系也在本研究中被發現，在＜60歲的病例中發生率明顯高于≥60歲的病例。上述結果表明，C-Myc和Bcl-2基因重排可能是DEL，尤其是DHL和（或）THL中C-Myc和Bcl-2雙表達的又一個重要分子機制。此外，本研究發現，有3例DEL為同時發生Bcl-2和Bcl-6基因重排，Hans分型是GCB-DEL，沒有發生骨髓浸潤，R-CHOP治療后都得到緩解。這說明DEL中不同的基因重排與其臨床過程和療效有關，Bcl-2和Bcl-6基因重排與DEL較好的臨床過程和療效可能有關，這有待進一步擴大研究和延長隨訪時間進一步觀察。本研究還發現3種基因重排的發生與DEL患者的臨床分期、IPI、血清LDH水平及EB病毒感染無關。

眾所周知，瘤細胞分子遺傳學的改變對患者生存預后會產生明顯的影響。關于C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排以及DHL和（或）THL對患者預后及生存率的影響報道不一，既往研究認為C-Myc重排陽性、Bcl-2重排陽性及DHL和（或）THL是較差的OS標志[17]，而對于Bcl-6基因重排陽性對患者預后的影響目前尚未統一。本研究發現，Bcl-6基因重排陽性患者的生存狀況則較陰性患者差。而單一的C-Myc或Bcl-2基因重排、DHL陽性和陰性病例之間生存狀況沒有明顯差異，COX多因素回歸分析發現，3種基因重排及3種蛋白表達都不是C-Myc和Bcl-2雙表達DLBCL的預后相關因素。這一結果可能與本研究病例數少和回顧性研究的局限性相關，因此有關C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排對于DEL臨床過程和預后的研究，還需要進一步開展更大樣本量、多中心和前瞻性隊列研究。

綜上所述，DEL病例中有較高的C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排發生率，而且與患者的年齡和Hans分型有關，不同的基因重排發生與DEL的臨床過程和預后有一定影響，應該常規進行這3種基因重排檢測為臨床治療方案的確定提供依據并發現預后不良的相關因素。