石油污染土壤微生物修復研究進展

付保榮 劉述鳳 鄢雨朦 張潤潔 郭宏偉

（1. 遼寧大學環境學院，遼寧沈陽 110000；2. 鞍山市生態環境事務服務中心，遼寧鞍山 114000）

1 引言

石油在勘探、開采、運輸、提煉、存儲、使用等過程中會因為管理不當或發生突發事故等導致石油污染，對環境造成既長遠又嚴重的危害。數據表明［1］，世界上每年有800 萬t 左右的原油進入環境，對土壤、地表水、地下水造成嚴重污染。土壤中的石油類污染主要來源于油井泄漏、原油管道及儲油罐泄漏、海洋溢油事故、石油類產品消耗等。石油污染土壤的主要特點為覆蓋面積大、潛伏周期長、治理難度大等，對農業、人體健康產生較大影響。

石油污染土壤修復技術手段通常包括以下3種：物理修復技術、化學修復技術、生物修復技術。在工程應用方面，物理修復技術操作較為困難、投資較大；化學修復技術容易給土壤環境帶來損害，極易發生二次污染并且污染影響難以評價；生物修復技術屬于環境友好型技術，具備無二次污染產生、投資較低、操作便捷等優點。因此，生物修復技術被認為是工程上最理想的修復石油污染土壤手段。

本文主要對國內外石油污染土壤微生物技術的研究成果進行梳理，在此基礎上合理進行展望，為石油污染土壤生物修復工程應用提供參考。

2 石油污染的危害

石油組成復雜，大體可以分成2 類：一類是烴類物質，占石油成分的95%～99.5%；另一類是非烴類物質，主要包括氧、氮、硫、氯、硅、磷等非金屬元素以及微量的重金屬元素。

石油對土壤會產生持久并且嚴重的損害，主要影響包括：（1）對土壤理化性質的影響。石油類污染物質進入土壤中后，會降低土壤通透能力，打破土壤中的原有平衡，破壞土壤的理化性質、營養物質組成、生物群落結構等。Wang 等［2］研究發現，土壤中浸入石油類污染物質后，有機碳含量、C/N、C/P、pH 有所增加，總氮含量有所減少，總磷含量以及電導率變化不明顯。（2）對農作物的影響。主要體現在農作物發芽率降低、成活率降低、抗性減弱、生長周期變長、結實率低等［3］。（3）對人體健康的影響。土壤中的石油類污染物質能夠隨地表水浸入地下水中或者通過植物富集作用進入人體內。當毒性較強的多環芳烴（如PAHs）進入人體后，能夠對身體器官造成傷害，輕者會使人體免疫力降低，重者會誘導癌變、胎兒畸形等情況發生。Bansal 等［4］對PAHs 可能通過食物進入人體內的途徑進行匯總，當進入人體中的PAHs劑量達到一定值時，就會對腎、肝、肺等器官產生影響，輕者影響正常功能，重者會導致癌變。（4）對土壤中水體的影響。土壤與地下水之間相互連通，當土壤中的石油類物質滲入地下水中，就會對地下水的物理性質、化學性質產生影響，導致地下水水質變差。使用受污染的地下水會造成土壤二次污染，若飲用則會對人體健康產生影響。（5）對空氣的影響。空氣與土壤直接接觸，土壤中的石油類污染物中有些具有揮發性，當環境達到一定條件時，其就會向大氣中擴散，造成大氣污染，人、動物通過呼吸將污染物吸進體內后可能引發中毒，影響機體正常功能。

3 環境中降解石油的微生物及作用機理

3.1 降解石油微生物

自然環境中存在很多以石油烴為唯一碳源和能源生長的微生物，對石油類污染具有降解作用的微生物大多集中于土壤、水中等。據統計，目前已經發現100 多個屬、200 余種利用氧化方式降解一種或多種石油烴污染物質的微生物，主要包括細菌和真菌。細菌主要用來降解海洋環境中的石油烴，真菌用來降解淡水或者陸地環境中的石油烴［5］。其中，降解石油效果較好的細菌包括假單孢菌屬（Pseudomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、無色桿菌屬（Achromobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、微球菌屬（Micrococcus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）、藍細菌屬（Cyanobacteria）、紅球菌屬（Rhodococcus）和弧菌屬（Vibrio）等；降解石油效果較好的真菌包括木霉屬（richoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、被孢霉屬（Mortierella）等［6］。

通過微生物降解石油類污染物質主要原因在于微生物種類繁多、分布范圍廣、個體小、繁殖能力強、比表面積大、容易馴化等。微生物通過體內一系列酶促反應，進而完成石油降解過程。在整個降解過程會發生多種作用，比如氧化還原、脫羧、脫氫、脫氨等，所以對石油降解、物質能量利用表現出更高效率。由于微生物自身具備的繁殖快、易于遺傳變異等特點，導致其內部酶體系能夠快速適應生存環境，不僅能夠在環境治理中表現出高效性和多樣性，又能夠避免發生二次污染［7］。

3.2 微生物降解石油的作用機理

利用微生物降解石油污染物時需要多種酶共同作用，是一種相對復雜的降解過程。一般來說［8］，石油化合物的生物降解包含3 個過程：第一步，石油類污染物質被吸附到微生物表面；第二步，被吸附的石油類污染物質被轉移到微生物細胞膜上；第三步，石油類污染物質在微生物的細胞中最終被降解成各種小分子物質。

目前，系統地對微生物降解石油污染物過程的研究正處于發展階段。自然環境中存在的石油類降解菌，絕大部分降解石油污染物單一，即一個菌株只能降解一種石油烴類污染。然而，實際石油污染土壤中存在多種烴類，此時就需要多種菌株共同參與以便充分降解石油污染物。由于多種菌株參與降解過程，導致探究石油降解菌生物降解過程機理的難度增加。關于微生物降解石油過程的研究主要分為烷烴和環烷烴降解過程［9］、芳香烴降解過程［10］、多環芳烴降解過程［11］。

烷烴和環烷烴降解過程見圖1

圖1 烷烴和環烷烴降解過程

芳香烴降解過程見圖2。

圖2 芳香烴降解過程

多環芳烴降解過程見圖3。

圖3 多環芳烴降解過程

4 石油污染土壤微生物修復技術

據統計，從20 世紀70 年代開始，石油的年產量呈現連續上升趨勢，于2008 年達到年生產的最大值。石油的大量開采及使用，導致石油污染土壤問題日益嚴重，安全高效的微生物修復石油污染土壤技術得到重視。目前，針對石油污染土壤微生物修復技術的研究主要集中在生物刺激法、生物強化技術、生物通風技術、固定化微生物技術、植物-微生物聯用技術等方面。

4.1 生物刺激法

生物刺激法主要針對的是石油污染土壤中的土著菌，人為地采用相應手段對土著菌進行刺激，進而加快其繁殖、生長速率并提高微生物活性，最終提高降解率。該方法主要是通過改變微生物外界生長環境，達到高效降解石油污染土壤的目的［12］。生物刺激法的顯著優勢在于其便于實施，整個修復過程無二次污染，工程應用前景可觀。但該方法存在一些弊端，如石油污染場地的土壤組成、水文地質條件等不盡相同，在實施生物刺激法時需要根據場地實際情況采取有效刺激手段。此外，土著微生物具有生長速度緩慢、代謝活性低等特點，限制了其對石油污染土壤的修復能力。

生物刺激法手段有很多，如改變土壤的pH、溫度、濕度，向土壤中通風，添加營養物質、電子受體、生物表面活性劑等。從工程的可操作性、成本以及降解效果等方面考慮，當下主要研究的刺激手段集中在投加營養物質、電子受體、生物表面活性劑。

土壤中微生物在新陳代謝過程中必須消耗C，N，P 等無機養分，因此增加營養物質的含量與比重對石油污染土壤的降解效果起到顯著作用。Chaineau等［13］以150 d 為實驗周期，將施肥土壤與未施肥土壤石油類污染物降解效果進行比較。結果表明，土壤中添加N，P，K 營養鹽對石油污染降解率高達62%，而未施肥土壤的降解率僅達到47%。李春榮［14］選取DX－3（微球菌屬）、DX－4（不動細菌屬）和DX－9（節細菌屬）3 種細菌進行實驗，均投加（NH4）2SO4及KH2PO4充當氮源和磷源，研究不同營養物質配比條件下3 種細菌對烴類污染的降解規律。實驗結果顯示，營養物質中C，N，P 的摩爾比達到60 ∶3 ∶1 時，降解石油污染效率達到最大值。此外，合理投加營養物質能夠提高生物降解石油污染土壤的速率。Emami等［15］研究了在氮源類型不同情況下，對石油污染土壤中微生物降解菌酶活性的影響，選取硝基氮和氨基氮進行了實驗。結果顯示，添加氨基氮后微生物酶活性提高明顯。

電子受體的種類與數量對微生物活性影響較大，因此合理地添加電子受體能夠提高降解石油烴類污染效率，是一種高效微生物刺激手段。通常選擇O2或者釋氧劑（主要成分為H2O2，MgO2，CaO2等）作為好氧微生物電子受體，選擇NO3－，SO42－，Fe3+以及有機物分解的中間產物作為厭氧微生物電子受體。李木金［16］選取CaO2作為釋氧劑，在研究釋氧過程以及影響因素的同時繪制了微生物生長曲線，結果表明，該釋氧劑的存在加快了微生物生長。Gallizia 等［17］選取MgO2作為釋氧劑，分別將微生物與釋氧劑添加到水中和土壤中，研究降解規律。實驗結果表明，投加MgO2后微生物酶活性有明顯提高，加快了降解速率。

石油污染土壤中的石油烴類污染物具有很強的疏水性，大大減小了與微生物的接觸面積，進而使降解效率降低。生物表面活性劑屬于一種無毒并且能夠在自然界中降解的活性劑，添加到石油污染土壤中能夠加快石油乳化，提高微生物對底物的利用率。同時使細胞表面具有更高的疏水性，確保細菌細胞能夠自由地與疏水底物相互作用，以此提高生物降解能力。梁生康［18］以鼠李糖脂作為生物表面活性劑，研究其對石油烴類污染物降解影響。結果顯示，加入鼠李糖脂后對石油烴類降解速率要比控制組提高3～4 倍。張強等［19］分別選取油酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、曲拉通100、吐溫80、鼠李糖脂作為生物表面活性劑，比較處理效率增加值。結果顯示，添加鼠李糖脂處理效率增加最大，與控制組相比增加8%左右。

4.2 生物強化技術

生物強化技術是指將特定功能的外來微生物或者馴化后的土著微生物投加到污染體系中，進而提高污染物降解效率。目前，在石油污染土壤中投加外源微生物已經取得一定成效。張瑞玲［20］通過從不同類型石油污染土壤中篩選出降解能力較強的混合菌株，經過一系列馴化，能夠降解65.2%的甲基叔丁基醚；Yi 等［21］在不同類型油田中篩選馴化出2 株高效石油降解菌，分別為枯草芽孢桿菌SWH－1 和多食鞘氨醇桿菌SWH－2，并將二者制成微生物制劑。將該微生物制劑應用于勝利油田污染場地，修復2 個月后，土壤中67.7%的石油被降解。

選擇生理能力和代謝能力強的菌株是生物強化技術的關鍵，雖然投加外源微生物降解石油污染土壤已見成效，但是限制因素較多，如會與土著微生物產生競爭、環境因素影響等。因此，通過富集并馴化后的土著微生物將更有優勢。Fodelianakis 等［22］進行了投加外源微生物與土著微生物降解效果比較實驗，選取Elefsina 灣海岸線附近某煉油廠的污染土壤為實驗場地。結果表明，投加外源微生物后石油降解效率提高不明顯，并且發現大量的外源微生物死亡。Ma 等［23］在一煉油廠污染場地中分離出21 種菌株，篩選后發現對石油具有高效降解作用的菌株有6 種。將6 種菌株混合后投加到該污染場地中，降解84 d 后測得石油污染物的降解率是控制組的3～4倍，達到了63.2%±20.1%。Roy 等［24］向石油污染土壤中添加本土原油降解菌，在控制實驗條件的基礎上，進行為期24 周的降解實驗。結果顯示，80%的原油在細菌與營養物質的作用下得到降解。綜上所述，通過富集、篩選土著微生物是目前生物強化技術中常用的高效修復手段。

4.3 生物通風技術

生物通風技術在本質上屬于一種生物刺激手段，其借助向土壤中補充氧氣加快微生物生長與代謝。屠明明等［12］分別采用自然降解方式與生物通風方式處理質量分數為4%的柴油污染土壤，60 d 后測得采用生物通風技術降解率達85%，而自然衰減降解率是64%，結果證明了生物通風技術可以提高微生物活性并提高降解能力。生物通風技術效率受多種因素控制，主要因素包括污染物性質、通風速率以及土壤理化性質（包括滲透能力、含水量、pH、營養物質含量）。Miller 等［25］在降解污染場地中苯系物時使用生物通風技術，主要控制的影響因素為土壤含水量。結果表明，當土壤中含水量在15%以下時，含水量的增加能夠加快微生物生長，提高降解能力；當土壤中含水量超過15%時，增加含水量會降低降解能力，這是因為增加的水分子填滿了土壤間隙，使土壤通透性變差。

4.4 固定化微生物技術

固定化微生物技術（IM 技術）指的是借助化學法或物理法，在恰當的載體上固定微生物或者酶。主要優勢體現在：（1）保護石油降解菌細胞的完整性以及生物酶活性，確保生化反應平穩進行；（2）單位介質中石油降解微生物數量增多，抵抗外界環境干擾能力增強；（3）延長微生物活性，提高其與土著微生物、噬菌體以及毒性物質的競爭能力，進而在惡劣、復雜的土壤環境中穩定地降解石油類污染物；（4）可循環利用；（5）便于操作、投資小。不足在于：（1）不可回收類載體材料對土壤環境存在潛在風險；（2）成分復雜的載體材料增加了微生物降解石油類物質的機理研究。

近些年，針對固定化載體材料的研究已經取得一定進展。研究人員通過實驗篩選出一些環境友好、無二次污染的載體材料。主要分為能夠自然降解材料和不可降解材料，又可以細分為無機載體（如高嶺土、硅藻土、蛭石、煤渣、微孔玻璃等）、天然材料（如瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、殼聚糖等）、有機材料（如聚乙烯醇、聚氨酯）、復合式材料以及其他［26］。

在篩選固定化載體時，應當遵守以下原則［27］：（1）理化性質穩定、機械強度高；（2）具備一定惰性，不會影響微生物原有作用；（3）容量大；（4）可重復使用，價格較低。

目前，主要在流體介質（如廢水）或者半流體介質（如污泥）中使用固定化微生物技術。在非流動介質（如污染土壤）中的使用正處于起步階段，發展前景可觀。童樂等［28］在降解原油時選擇稻草秸稈和玉米秸稈固定混合菌。結果表明，二者對原油降解率均超過90%，而對照組（游離菌）的原油降解率僅達到50%左右。方明亮［29］在降解氨氮時采取復合型載體（將硅藻精土加入海藻酸鈉中）固定氨氮降解菌，并在低溫條件下進行實驗。結果表明，該方式對氨氮的去除率接近80%。胡文穩等［30］從原油污染中獲得具有高降解原油能力的土著菌，構建復合型載體（海藻酸鈉和硅藻土），比較了固定化降解菌與游離菌對原油的降解能力。實驗初期（20 d）結果表明，同等條件下固定化降解菌降解原油能力要明顯高于游離菌。

通過研究人員的大量研究成果可知，固定化微生物技術在修復石油污染土壤領域有較大的發展潛力，并且具有較高的工程應用價值，未來可以從以下幾個方向研究固定化微生物技術：（1）改進固定化微生物技術，包括改進固定化載體（如使用納米材料）、固定化方法、微生物添加方式等；（2）微生物固定方法與菌種、載體的協同優化；（3）考慮工程實際情況，降低載體制作成本、簡化制作流程；（4）研究混合微生物固定化、基因工程菌固定化；（5）研究并評估固定化載體存在的環境風險。

4.5 植物－微生物聯用技術

在實際工程中，使用生物刺激、生物強化、微生物技術時受環境因素干擾較大，無法達到最佳降解效果，在此背景下，植物－微生物聯用技術應運而生。植物－微生物聯用技術指的是微生物與植物之間構成互利關系，以此達到高效降解有機物的目的。該技術機理為：植物根際向微生物提供生長繁殖場所以及運輸氧氣，確保微生物氧化過程穩定進行。與此同時，植物根際分泌物能夠對微生物產生刺激作用，進而提高微生物降解作用；微生物通過降解環境中污染物質，向植物提供能夠利用的化合物，使污染物毒性降低，結合植物根際的吸收作用，更好地降解石油類污染物質［31］。在運用該技術時，植物的最優選擇應該具備以下特征：（1）毛根系發達，最大程度地向微生物提供生存空間；（2）生長旺盛，具備一定抵抗有機污染能力；（3）植物根系能夠向更深土層生長。

近幾年，利用植物－微生物聯用技術修復石油類污染土壤已經取得一定進展。中國科學院南京土壤研究所采用將紫花苜蓿與根瘤菌劑和菌根菌劑聯合，處理長期持久性有機污染物（POPs）復合污染土壤。結果表明，轉化土壤中POPs 能力有所提高，污染物的降解效果和消減效果明顯增強［32］。徐莉等［33］采用植物－微生物聯用技術修復多氯聯苯（PCBs）污染土壤，選取的植物為紫花苜蓿，微生物為苜蓿根瘤菌或地表球囊霉。實驗表明，種植植物區域的去除率均大于對照組，紫花苜蓿與苜蓿根瘤菌聯用時，PCBs 去除率為42.6%。馬強等［34］發現利用水稻－微生物聯用技術降解石油污染土壤效果較好，在培養階段降解率為53.13%。

盡管植物－微生物聯用技術已經獲得一定成果，但其在工程應用方面仍然存在一定局限性，在今后研究中應該側重以下幾方面：（1）科學合理選取植物及微生物，完善工藝過程，減少投入成本；（2）研究二者聯合作用機理、協同修復機制及影響因素；（3）研究植物根際微生物生理特征以及植物根際物質和能量受污染物成分與濃度的影響。

5 未來研究方向

5.1 高效降解菌劑開發

如何選擇適當微生物是生物修復技術的核心，不同生物或者相同生物在不同的污染土壤環境中表現的生理特征不同，因此需要借助實驗確定最佳微生物。原位修復時，通過實驗室的篩選、培養可以提高微生物修復成功概率。目前，寡核苷酸微陣列方法是應用最多、效果最好的篩選降解土壤污染微生物的方法，其利用原位診斷的方式確定滿足修復該場地的菌株。通過DNA 診斷結果來確定該菌株的有效性，能夠減少實驗次數和錯誤。此外，通過該方法能夠明確原位修復的位置點，并且能夠對生物修復的進程進行評估。

生物修復過程中應該注重研究石油對微生物降解的影響，這有利于菌種的選擇。研究證實，石油類污染與微生物長期相互作用會使微生物某些生理特征發生改變，比如細菌與柴油長期發生相互作用，能夠形成天然柴油表面活性劑。其與柴油表面活性劑接觸并作用后，能夠明顯地改變Zeta 電位和脂肪酸，進而對修飾編碼基因成分產生影響，造成長久與石油類污染作用的微生物遺傳物質發生變化。此外，原油同樣會影響微生物的數量、成分以及功能，借助分析元蛋白質成分明確污染物質與微生物種群間的作用關系和系統發育關系，可以對生物降解原理有更深層次的認識，進而才能夠從遺傳學、基因學角度篩選出最佳菌株。

5.2 環保的營養添加劑

生物修復過程中，合理投加無機營養物質能夠有效提高修復效果，然而投加的無機營養物質會浸入水體中，造成地下水和地表水污染。因此，尋找可以取代無機營養物質的環境友好型替代品成為研究方向。當下研究的替代品包括植物、動物以及有機物。此外，一些學者研究了毒性較低、容易降解、抗性強（如高溫、堿性條件）的表面活性劑。Ayed 等［35］從芽孢桿菌中成功分離出生物表面活性劑，通過實驗發現，該表面活性劑受溫度、pH、鹽度影響很小，并且對柴油溶解度較高，比SDS 以及吐溫80 高10%，生物降解率增加30%。該實驗證明，從生物菌株獲取環境友好型表面活性劑用于降解石油污染土壤是可行的。

5.3 生物修復新技術研究

石油污染土壤修復工程非常注重最佳降解率的操作參數。在此背景下，響應面法得到重視，其能夠有效地優化生物過程。lvarez 等［36］以南極石油污染土壤為例，采用響應面法對生物修復參數進行優化。結果表明，當C ∶N ∶P＝100 ∶17.6 ∶1.73 時的柴油去除率最高，為54.9%，相比于C ∶N ∶P＝100 ∶10 ∶1 時的27.8%的去除率有了顯著提高。與此同時，通過響應面法能夠減少肥料投加量。由此可知，響應面法在優化石油污染土壤操作參數方面發揮了重要作用，接下來應該更深層次地研究響應面法優化操作參數的適應性。

6 結論

（1）生物修復技術降解石油污染物效果毋庸置疑，是一種經濟型、環境友好型修復技術。但是，其存在處理周期長、微生物群落活性不穩定等弊端，導致實際應用中無法達到預期降解效果。

（2）將來應著手研究特種微生物、轉基因微生物。借助DNA 診斷方法，以遺傳學、基因學為出發點，篩選具有高效降解能力的微生物。

（3）微生物聯合修復技術能夠有效提高降解效果，是工程應用的關鍵切入點，未來應側重對微生物聯合修復技術的研究。

（4）更規范的生物修復參數將成為未來研究工作的重點。