紅樹林根際土壤中耐高鹽苯酚降解菌的分離鑒定

曹宏明，龔 斌，朱麗娟，潘貴妮，劉飛琪，李世盛

(1.廣西北部灣海洋災害研究重點實驗室，廣西 欽州 535011； 2.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 535011； 3.北部灣大學海洋學院，廣西 欽州 535011)

苯酚是一種常見的工業(yè)原料，對動物具有明顯的急慢性毒性[1-4]。在海洋環(huán)境中，苯酚廣泛存在于海水[5]、沉積物[6]及各種海洋生物體內[7-8]，對海洋生態(tài)環(huán)境具有潛在的威脅。近10年來，許多研究者分離出上百種能降解苯酚的微生物，并對菌株的降解特性和降解形式做了全面深入的研究[9-14]。國內外已分離和鑒定的苯酚降解菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)[15]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[11-12,16-17]、不動桿菌屬(Acinetobacter)[18]、無色桿菌屬(Achromobacter)[19]等，真菌有鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)[20]、羅爾斯頓菌屬(Ralstonia)等[21]。但是，從海洋環(huán)境中分離降解苯酚的微生物的研究還比較少，胡忠等(2007)報道從海洋沉積物中分離、篩選到一株能以苯酚作為唯一碳源和能源的假絲酵母菌(Candidasp.)，其能在較高含量的苯酚條件下生長，在72 h內可以降解苯酚95%以上[22]。Fumihisa等(2012)從海洋動物體內分離的細菌Acinetobactersp. EBR01和Acinetobactersp. EBR02 可以降解海水中的苯酚[23]。Hideshi等(1992)從高鹽的樣品中分離得到嗜熱嗜鹽的苯酚降解菌嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)和根瘤菌科的細菌[24]。Sivasubramanian等(2016)從紅樹林蟹類腸道中分離到的降酚菌包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬(Staphylococcus)[25]。Zhou等(2016)從太平洋的熱液噴口中分離到苯酚降解菌嗜酸硫桿菌Sulfobacillusacidophilus，該菌通過Meta通路實現(xiàn)對苯酚的降解[26]。

廣西北部灣是我國海洋生態(tài)環(huán)境保護地最好的區(qū)域之一，擁有我國最大面積的紅樹林保護區(qū)和白海豚﹑鱟等珍稀物種。然而近年來，隨著臨海工業(yè)的發(fā)展，海洋環(huán)境也面臨著一定威脅。例如Wang等(2017)報道對35份茅尾海的表層沉積物樣品進行20種目標氯化多環(huán)芳香烴化合物檢測，發(fā)現(xiàn)有18種同系物被檢出[27]。因此非常有必要從海洋環(huán)境中分離高效苯酚降解菌并進行深入研究。本研究從廣西北部灣紅樹林根際土壤中分離出能高效降解苯酚的菌種，并研究其降解特性，可為海洋生態(tài)環(huán)境修復工程提供一定的理論依據(jù)，對海洋生態(tài)系統(tǒng)保護、健康化養(yǎng)殖、海岸帶養(yǎng)護等都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和試劑

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10 g、酵母粉10 g、NaCl 5 g，蒸餾水定容至1 L。無機鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g、 CaCl20.1 g、 K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、NaCl 10 g、MgSO40.25 g、海水晶15 g, 蒸餾水定容至1 L。高鹽(70 g/L NaCl)無機鹽培養(yǎng)基：前述無機鹽培養(yǎng)基中NaCl增加至55 g即可。

1.2 細菌的富集和分離

本實驗所用菌株采自山口紅樹林國家級自然保護區(qū)﹑北海金海灣紅樹林、廣西茅尾海紅樹林自然保護區(qū)的紅樹林根際土壤。各取20 g采集的土壤樣本加入100 mL苯酚含量為400 mg/L 的高鹽無機鹽培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)7 d。移取培養(yǎng)液1 mL加入裝有100 mL高鹽無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入苯酚作為唯一碳源，連續(xù)轉接富集培養(yǎng)4次，苯酚梯度依次遞增為800、1 200、1 500、2 000 mg/L，最后取各梯度富集培養(yǎng)液涂布到500 mg/L苯酚為碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d后挑取形態(tài)上有差異的單菌落在含量為500 mg/L苯酚為碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板上劃線分離培養(yǎng)，得到純種的菌株, 再測定其苯酚降解特性。

1.3 菌體生物量和苯酚含量的測定

取5 mL培養(yǎng)液于12 000 r/min下離心10 min后, 用空白無機鹽培養(yǎng)基作為參比，沉淀以等量蒸餾水懸浮后測定其OD600值, 用來表示菌體生物量；上清液用于苯酚含量的測定, 采用4-氨基安替比林法進行[28]。

1.4 菌株的鑒定

菌株的生理生化特性鑒定參照文獻[29]進行, 菌株16S rRNA基因序列的擴增、測定和同源性比較參照文獻進行[30]。

1.4.1 降解菌株的16S rRNA與gyrBPCR擴增與測序 選取降解率高、生長速度快的不同種屬的菌株進行基因擴增，按照細菌基因組DNA提取試劑盒(Phygene)方法提取菌株DNA，以基因組DNA作為模板，進行菌株的16S rRNA和gyrBPCR擴增，16S rRNA基因擴增引物參考文獻[31]，gyrB基因擴增引物參考文獻[32]。反應體系(50 μL)：2×Taq MasterMix 25 μL，細菌通用引物4 μL，模板1 μL，超純水20 μL；反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。擴增產(chǎn)物送去南京金斯瑞生物科技有限公司測序，16S rRNA序列用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，gyrB序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中用NCBI-BLAST軟件進行同源性比較。取同源性較高的序列，用Mega 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.2 菌株DNA BOX-PCR遺傳多樣性分析 本研究BOX-PCR引物參考文獻[33]。10 μL反應體系：2×Taq MasterMix 5 μL，引物2 μL，模板1 μL，超純水2 μL。BOX-PCR 反應程序：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，30個循環(huán)；65 ℃延伸18 min，12 ℃保存。

1.5 苯酚降解菌的降解特性

1.5.1 苯酚降解曲線 取在20%甘油中保藏的苯酚降解菌種100 μL接入5 mL的LB培養(yǎng)液中過夜活化，然后轉接1 mL菌液加入苯酚含量為1 000 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，放入28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。分時段取樣測定苯酚降解率及菌體OD600值。

1.5.2 環(huán)境因素影響 分別研究溫度(20、25、30、35、40 ℃)、pH(2、4、6、8、10)、NaCl含量(20、40、60、80、100 g/L)對菌株苯酚降解率的影響。

1.5.3 降解譜的測定 分別向以含量為200 mg/L的鄰苯二酚、對苯二酚、蒽、萘、甲苯、二甲苯、苯甲酸鈉、鄰二氯苯和間苯二酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，按1∶50(V/V)接入活化的降解菌，于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)。用紫外分光光度計在200 nm波長下測定培養(yǎng)上清液中上述芳香化合物的含量，結合細菌的生長情況，判斷苯酚降解菌的降解譜。

2 結果與討論

2.1 紅樹林根際土壤中苯酚降解菌的分離

經(jīng)對山口紅樹林國家級自然保護區(qū)﹑北海金海灣紅樹林﹑茅尾海紅樹林自然保護區(qū)的紅樹林根際土壤分別富集培養(yǎng)，得到苯酚降解菌30株。從山口紅樹林國家級自然保護區(qū)根際土壤中純化了16株，其中耐高鹽(70 g/L NaCl)環(huán)境降解菌有11株；從北海金海灣紅樹林自然保護區(qū)根際土壤中純化了11株，耐高鹽(70 g/L NaCl)環(huán)境有6株；從茅尾海紅樹林自然保護區(qū)土壤中純化了3株，都不能耐高鹽(70 g/L NaCl)環(huán)境。經(jīng)過BOX-PCR實驗證明，這30株菌株具有相似的電泳多態(tài)性特征。30株菌株的苯酚降解率如表1所示，當苯酚含量為1 000 mg/L時，有5株苯酚降解菌在48 h后降解率達80%以上，降解苯酚的效率比較高。這5株菌株都能耐受70 g/L NaCl的高鹽環(huán)境，其中3株來自山口紅樹林國家級自然保護區(qū)，有2株來自北海金海灣紅樹林自然保護區(qū)，編號分別是FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5。

表1 紅樹林根際土壤中苯酚降解菌的降解率Tab. 1 Degrading rate of phenol-degrading bacteria from rhizosphere soil of mangrove

2.2 高效苯酚降解菌株的鑒定

經(jīng)過鑒定分離到的5株苯酚降解菌菌落光滑，革蘭氏染色為陰性，呈桿狀，能運動，不能發(fā)酵葡萄糖。提取菌株FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5的總DNA，進行16S rRNA基因擴增。通過Clustal W軟件多序列比對分析表明，來自山口紅樹林國家級自然保護區(qū)的菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11的16S rRNA序列完全相同，而來自北海金海灣紅樹林自然保護區(qū)的菌株FGYB1和FGYB5 16S rRNA序列完全相同，而以上兩組序列僅在3個位點存在差異。

將菌株的序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的細菌16S rRNA序列進行相似性比較，5株苯酚降解菌均屬于假單胞菌屬。菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11與假單胞菌Pseudomonasextremaustralis14-3T和PseudomonasmeridianaCMS 38T的16S rRNA序列相似性分別達到99.71%和99.64%。菌株FGYB1和FGYB5與假單胞菌PseudomonasveroniiDSM 11331T和Pseudomonasextremaustralis14-3T的16S rRNA序列相似性均達到99.64%。通過16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果表明菌株FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5在進化上與P.veronii為同一個分支(圖1)。

圖1 苯酚降解菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of the phenol-degrading bacteria

經(jīng)檢測菌株FGYS1與假單胞菌PseudomonasextremaustralisDSM 17835T的gyrB序列相似度最高，為92%。通過對菌株FGYS1與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他gyrB序列的比對分析，我們構建了基于gyrB序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明菌株FGYS1與假單胞菌PseudomonasextremaustralisDSM 17835T在同一個分支(圖2)。

2.3 苯酚降解特性

2.3.1 苯酚降解菌的降解能力 菌株FGYS1 可3 d后完全降解1 500 mg/L苯酚，菌株FGYB1可5 d后完全降解1 500 mg/L苯酚。以含量為1 000 mg/L的苯酚作為唯一碳源，菌株FGYS1和FGYB1在40 h時將苯酚完全降解(圖3)。兩株菌株的生長速度和其對苯酚的降解率均呈線性增長，菌株FGYS1在30 h時苯酚的降解率達到79%，菌株FGYB1在30 h時苯酚的降解率為63%，菌株FGYS1的降解速度快于菌株FGYB1。

2.3.2 環(huán)境因素對菌株苯酚降解率的影響 微生物的生長和降解特性對環(huán)境條件的變化較為敏感，本研究探討了溫度、鹽度和pH等因素對菌株FGYS1和FGYB1生長速度及降解苯酚性能的影響。如圖4(a)所示，菌株FGYS1在20～30 ℃時，其菌體生長速度和對苯酚的降解率均隨溫度的升高而增大，在30～35 ℃時對苯酚的降解率和生長速度達到最大；當苯酚的初始含量為500 mg/L時在24 h時將苯酚完全降解，而高于35 ℃時隨溫度的上升苯酚的降解率明顯降低；如圖4(b)所示，菌株FGYB1在20～25 ℃時菌體生長速度和對苯酚的降解率隨溫度升高而增大，在25～30 ℃時對苯酚的降解率和生長速度達到最大；當苯酚的初始含量為500 mg/L時在24 h將苯酚完全降解，而高于30 ℃時隨溫度的上升苯酚的降解率明顯降低。

圖2 苯酚降解菌gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of gyrB gene sequence of the phenol-degrading bacteria

圖3 苯酚降解菌生長曲線及其對苯酚的降解率Fig. 3 Growth curves and phenol degradation by strains FGYS1 and FGYB1

pH對苯酚降解率影響的實驗結果(圖5)表明，當溶液中苯酚含量為1 000 mg/L時，菌株FGYS1在初始 pH為2～4時生長速度和對苯酚的降解率隨 pH的增大而升高，在pH為4 時苯酚降解率達到最高(66%)，此時菌體生物量也達最大(OD600值為0.779)，最適pH為4。當pH大于4時，隨著 pH的增大，菌株FGYS1的生長速度和對苯酚的降解率呈下降之勢。菌株FGYB1在初始 pH為2～4時菌體生長速度和對苯酚的降解率隨 pH的增大而升高，在pH為4時達到最高，隨后菌體生長速度和苯酚降解率隨 pH 值的增大而降低。以上結果說明，兩株菌株在酸性條件下生長情況和降酚能力較好，在偏堿性條件下生長緩慢且苯酚降解率下降。

菌株FGYS1在NaCl含量為20～40 g/L時菌株降解苯酚效果好[圖6(a)]，24 h后對含量為500 mg/L的苯酚降解率可達100%；在NaCl含量大于40 g/L時，菌株的生長速度和對苯酚的降解率開始受到抑制。經(jīng)培養(yǎng)72 h后，苯酚在NaCl含量為60 g/L的條件下可被完全降解，在NaCl含量為80 g/L 時5 d后可被完全降解，在NaCl含量為100 g/L的情況下菌株生長速度和降解率都受到嚴重抑制。菌株FGYB1的生長速度和對苯酚的降解率隨NaCl含量的增大而下降[6(b)]，但在NaCl含量為100 g/L時培養(yǎng)4 d后500 mg/L苯酚也能被完全降解。說明高鹽度影響降解菌的生長速度和對苯酚的降解率，NaCl含量大于40 g/L時明顯延緩了苯酚的降解速度，但兩株菌株都有很強的耐高鹽能力。

圖4 溫度對苯酚降解菌的降解率與生長的影響Fig. 4 Effects of temperature on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

圖5 pH對苯酚降解菌的降解率與生長的影響Fig. 5 Effects of pH value on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

圖6 NaCl含量對苯酚降解菌的降解率與生長的影響Fig. 6 Effects of sodium chloride concentration on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

2.3.3 苯酚降解菌的降解譜 研究表明，苯酚降解菌FGYS1和FGYB1的降解譜相同。在有機物含量為200 mg/L時，菌株FGYS1和FGYB1能夠分別在以鄰苯二酚、對苯二酚和間苯二酚為唯一碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基中生長，并將有機物完全降解。其他被檢測的有機物如蒽、萘、甲苯、二甲苯、苯甲酸鈉和鄰二氯苯不能被降解。

2.4 討論

隨著我國經(jīng)濟發(fā)展，很多沿海城市布局了芳香烴類企業(yè)。廣西北部灣原本是我國近海海洋環(huán)境最好的地區(qū)之一，近年來也在欽州港布局了多個芳香烴化工企業(yè)，這給環(huán)境造成了很大壓力。從海洋環(huán)境中分離獲得高效芳烴降解菌，不僅對海洋微生物資源的利用具有重要意義，也為海洋生態(tài)修復和保護奠定了很好的基礎。研究表明，向苯酚污染的環(huán)境中引入苯酚降解菌，有利于環(huán)境的改善。例如，Ibáez等(2014)報道，向環(huán)境中引入一種降酚的芽孢桿菌后，可以明顯促進苯酚污染的環(huán)境中箭筈豌豆(Viciasativa)根的伸長率和發(fā)芽指數(shù)，并且可以加速去除土壤中的酚污染[34]；Cordova-Rosa等(2009)研究表明，向活性污泥中引入一種苯酚降解菌(Acinetobactercalcoaceticus, 最高可降解苯酚含量為1 200 mg/L)，可以明顯強化活性污泥的苯酚降解能力，經(jīng)過20 d的生物強化，污泥-土壤基質的殘留苯酚含量為1.13 mg/kg[35]。本研究從廣西北部灣紅樹林根際土壤中分離的高效苯酚降解菌，不僅降酚能力非常強(最高可降解含量為1 500 mg/L的苯酚)，而且具有能夠適應本土紅樹林環(huán)境的優(yōu)點，還兼具耐高鹽、耐酸和同時降解多種芳香化合物的特性，在應對將來紅樹林芳烴污染和生態(tài)環(huán)境修復方面顯示了較大的潛力。

目前發(fā)現(xiàn)和研究比較多的假單胞菌屬苯酚降解菌有Pseudomonasfluorescence[36]、Pseudomonasaeruginosa[37]、Pseudomonasputida[38]和Pseudomonaspseudoalcaligenes[39]等菌株，還有其他未被鑒定到種的假單胞菌屬苯酚降解菌[40-41]。本研究從紅樹林根際土壤中發(fā)現(xiàn)的苯酚降解率最高的菌株FGYS1通過16S rRNA和gyrB序列比對分析，進化關系上與P.extremaustralis和P.veronii關系較近。Tribelli等(2018)的研究表明，P.extremaustralis具有降解烷烴的能力[42]；另有研究發(fā)現(xiàn)P.extremaustralis具有很強的極端環(huán)境適應能力[43]。P.veronii曾被發(fā)現(xiàn)具有降解甲苯[44]和苯[45]的能力。但是P.extremaustralis和P.veronii目前均沒有報道可以降解苯酚。

本研究從北部灣3個不同的紅樹林區(qū)根際土壤中最終篩選得到的5株耐高鹽的高效苯酚降解菌，其16S rRNA序列非常接近，來自山口紅樹林國家級自然保護區(qū)的菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11的16S rRNA序列完全相同，而來自北海金海灣紅樹林自然保護區(qū)的菌株FGYB1和FGYB5的16S rRNA序列完全相同，而以上兩組序列僅在3個位點存在差異，這印證了Rutger等(2006)提出的微生物全球分布的假說(即Baas Becking假說)，該假說認為不同環(huán)境中微生物的差異是由環(huán)境決定的[46]。本研究中，可能苯酚降解菌的類型特征在不同紅樹林生境中是隨機分布的，所以我們從北部灣幾個不同紅樹林區(qū)根際土壤中得到的耐高鹽的高效苯酚降解菌的分類地位是相同的，只是由于不同的紅樹林環(huán)境的選擇作用，導致不同生境中的苯酚降解菌會向不同的遺傳方向突變和進化。

3 結論

(1)從北部灣紅樹林根際土壤中篩選到5株耐高鹽的高效苯酚降解菌，為假單胞菌屬，最高可降解含量為1 500 mg/L的苯酚。菌株FGYS1和FGYB1可分別3 d和5 d后完全降解1 500 mg/L苯酚。

(2)菌株 FGYS1 降解苯酚的適宜溫度為25～35 ℃、適宜pH為4～6、最高耐NaCl含量為60 g/L。菌株 FGYB1 降解苯酚的適宜溫度為25～35 ℃、適宜pH為4～6、最高耐NaCl含量為100 g/L。菌株FGYS1和FGYB1對pH、溫度和鹽度的適應范圍較廣，具有應用于苯酚污染的生態(tài)環(huán)境修復的潛力。

(3)菌株FGYS1和FGYB1能夠分別在以鄰苯二酚、對苯二酚和間苯二酚為唯一碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基中生長。