丁卡因通過MDM2基因下調Survivin蛋白抑制黑色素瘤生長

伍春林,易 鵬,黃 祥,馮建國,姜 鮮,2*

(1 西南醫科大學附屬醫院麻醉科，瀘州 646000；2 瀘州市人民醫院麻醉科;*通訊作者,E-mail:jiangkeke303@163.com)

黑色素瘤是一種侵襲性極強的惡性腫瘤，是發病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。臨床研究表明，早發現并盡早進行手術切除是治療黑色素瘤的最佳選擇[2]。而術后原發腫瘤的復發和轉移是患者預后不良的主要原因[3]。回顧性研究表明，局麻藥的使用在減少術后原發腫瘤復發和轉移中起到積極的作用[4,5]。大量的證據也表明局麻藥可以通過直接細胞毒性和誘導細胞凋亡，抑制增殖、遷移和侵襲，以及通過甲基化調節基因表達等表現出顯著的腫瘤抑制作用[6]。局麻藥可通過多種作用機制抑制癌細胞的生長和轉移，并隨局麻藥的種類、濃度及癌細胞類型而不同[7]，因此局麻藥抑制腫瘤的分子機制還需深入探究。Werdehausen等[8]和Kobayashi等[9]的研究表明丁卡因似乎具有較強的腫瘤抑制效力。而目前關于丁卡因對腫瘤作用的研究較少，且缺乏機制研究。為此，本研究就局麻藥丁卡因對黑色素瘤生長的影響及機制展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 鹽酸丁卡因(天興)，溶于無菌生理鹽水中配置成0.2 mol/L的母液，隨后根據實驗需求用細胞培養基配成0，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L的培養液，現配現用。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、高糖DMEM(美國Hyclone)，MTT試劑、BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，MDM2抗體(美國Santa)，Survivin抗體(中國ZEN BIO公司)，GAPDH抗體(中國Proteintech公司)，CO2培養箱(美國Thermo Scientific)，全自動酶標儀(美國Bio-Tek)，電泳儀、濕轉槽(美國Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A375和B16黑色素瘤細胞為西南醫科大學麻醉實驗室常規保存。A375和B16均采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養，單層貼壁培養于CO2培養箱中(37℃，5%CO2)。當細胞融合度達到70%-80%時進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測丁卡因對黑色素瘤細胞活力的影響 取對數生長期的黑色素瘤細胞(A375和B16)，胰酶消化、細胞計數后，A375(3×104個/ml)和B16(1×104個/ml)接種于96孔板，每孔100 μl。過夜后，A375細胞予以0，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干預24 h；B16細胞則予以0，0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因處理24 h。小心吸棄上清液，每孔加入100 μl含10 μl MTT的新鮮培養液，4 h后更換為100 μl二甲基亞砜孵育15 min。用酶標儀測量560 nm處的光密度值(optical density，OD)，認為0 mmol/L組的細胞活力為100%，作為對照，抑制率=(1-丁卡因組OD560/對照組OD560)×100%，計算IC50。

1.2.3 細胞集落實驗檢測丁卡因對黑色素瘤增殖能力的影響 將生長良好的A375和B16細胞均勻接種于6 cm培養皿(A375：1×103個/皿，B16：600個/皿)，隨機分為對照組、丁卡因0.05 mmol/L組、丁卡因0.10 mmol/L組、丁卡因0.15 mmol/L組，相應地予丁卡因0，0.05，0.10，0.15 mmol/L干預24 h后，更換新鮮培養基繼續培養待集落形成，結晶紫染液染色后計數集落(大于或等于50個細胞的集落)。

1.2.4 Western blot檢測Survivin及MDM2的表達水平 取融合度約為70%-80%的黑色素瘤細胞A375和B16，予丁卡因處理24 h(根據1.2.2中IC50結果，A375細胞予0.4 mmol/L丁卡因，B16細胞予0.2 mmol/L丁卡因)，對照組給予等體積生理鹽水處理24 h。用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白，BCA蛋白定量后制備蛋白樣品。經12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉至NC膜，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后洗膜并轉入相應一抗中(Survivin 1 ∶1 000、MDM2 1 ∶200、GAPDH 1 ∶5 000)，于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應二抗中室溫孵育1 h，再次洗膜，ECL顯影、曝光成像。分析丁卡因干預后細胞中相應蛋白變化(Image J軟件)。

1.2.5 動物實驗 取12只雄性BALB/C小鼠(成都達碩，6-8周齡，體質量21-26 g)隨機分為對照組(n=6)和丁卡因組(n=6)，均于小鼠右側背部皮下注入B16細胞0.1 ml(約5×106個)，待小鼠背部成瘤后，丁卡因組經腹腔注射丁卡因干預(20 mg/kg)，對照組經腹腔予等體積生理鹽水作為對照，隔天給藥，1周后取下腫瘤組織，觀察腫瘤組織大小并稱重記錄。

1.2.6 免疫組化法檢測腫瘤組織中Survivin的蛋白表達水平 將腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，經蔗糖梯度脫水，石蠟包埋后切片，依次進行：脫蠟；水化；抗原修復；血清封閉孵育；滴加Survivin抗體；孵相應二抗；顯色劑顯色；復染后梯度脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。觀察并拍照后分析Survivin表達變化(Image J)。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丁卡因抑制黑色素瘤細胞活力

丁卡因顯著抑制了黑色素瘤細胞A375和B16的細胞活力，呈濃度依賴性(見圖1)。與空白對照相比，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L丁卡因干預24 h，A375細胞活力分別被抑制24%，48%，81%，93%，差異有統計學意義(P<0.001)，半數抑制率(IC50)約為0.41 mmol/L。0.1，0.15，0.2，0.3 mmol/L丁卡因處理24 h，B16細胞活力分別被抑制14%，51%，62%，92%，差異有統計學意義(P<0.001)，B16細胞半數抑制率(IC50)為0.16 mmol/L。丁卡因對于B16細胞的IC50低于對A375細胞的IC50，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2 丁卡因抑制黑色素瘤細胞集落形成

集落實驗結果顯示，0.05，0.10，0.15 mmol/L丁卡因分別干預黑色素瘤細胞A375和B16后，與對照組(0 mmol/L)相比，丁卡因組集落數量隨丁卡因濃度增加逐漸減少(P<0.001，見圖2)。

與對照(100%)相比，* * * P <0.001圖1 丁卡因對黑色素瘤細胞活力的影響Figure 1 Effect of tetracaine on cell viability of melanoma

與對照組(0 mmol/L)相比，* * * P <0.001圖2 丁卡因對黑色素瘤細胞集落形成的影響Figure 2 Effect of tetracaine on colony formation of melanoma

2.3 丁卡因下調Survivin和MDM2蛋白的表達

本實驗檢測了丁卡因干預后黑色素瘤細胞內Survivin蛋白及其上游蛋白MDM2的表達變化，結果顯示，在A375及B16細胞中，丁卡因干預后MDM2蛋白的表達明顯下調(P<0.001)；同時Survivin蛋白的表達也明顯減少(P<0.001，見圖3)。

2.4 丁卡因抑制小鼠皮下黑色素瘤的生長

實驗過程中未觀察到小鼠出現明顯不良反應。實驗結束時對照組取得6個明顯瘤體；丁卡因組取得4個明顯瘤體，另外兩只小鼠解剖皮下后僅可見黑斑殘余(質量記為0 g)。與對照組相比，腹腔注射丁卡因可明顯抑制小鼠皮下黑色素瘤的生長，其瘤體質量明顯降低(P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，* * * P <0.001圖3 丁卡因對黑色素瘤中MDM2和Survivin蛋白表達影響Figure 3 Effect of tetracaine on the expression of MDM2 and Survivin proteins in melanoma

圖4 丁卡因對小鼠皮下黑色素瘤的影響Figure 4 Effect of tetracaine on the growth of subcutaneous melanoma in mice

2.5 丁卡因使黑色素瘤組織中Survivin蛋白的表達下降

相比于對照組，丁卡因組黑色素瘤組織中Survivin蛋白表達明顯減少(P<0.001，見圖5)，提示丁卡因下調了黑色素瘤組織中Survivin蛋白的表達。

圖5 丁卡因下調黑色素瘤組織中的Survivin (DAB染色)Figure 5 Tetracaine down-regulates the level of Survivin in melanoma tissue (DAB staining)

3 討論

雖然局麻藥經常用于腫瘤患者的外科手術及癌痛的控制，但局麻藥在腫瘤生物學中的意義尚不清楚[5]。臨床證據表明局部麻醉能夠影響腫瘤術后轉移的病理生理過程并減少腫瘤的復發，包括乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌以及黑色素瘤[5,6,10-12]。然而是局麻藥本身的作用還是麻醉技術的影響抑或是它們的聯合作用抑制了腫瘤的進展需要進一步探索。在本研究中，我們采用黑色素瘤模型探究了酯類局麻藥丁卡因的抗腫瘤作用。此外，我們還建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，研究了丁卡因在活體上的抗腫瘤作用。丁卡因在細胞及動物水平上都能明顯抑制黑色素瘤，這為丁卡因在腫瘤手術及術后鎮痛、癌痛鎮痛等方面提供了潛在應用價值。

我們首先通過A375和B16兩種黑色素瘤細胞系研究了丁卡因對腫瘤的作用。A375是人來源的黑色素瘤，B16是鼠來源的黑色素瘤。A375和B16在黏附蛋白、營養因子的產生和基因圖譜等重要方面有差異，具有不同的遺傳特點，是研究黑色素瘤的常用細胞系[13]。結果顯示，丁卡因以濃度依賴的方式抑制黑色素瘤A375和B16細胞活力，IC50分別為0.41 mmol/L和0.16 mmol/L。值得注意的是，丁卡因對B16細胞的IC50明顯低于A375細胞的IC50(P<0.001)，具有較高增殖能力的B16對丁卡因的反應更加敏感。此前Gregoire等[14]也發現羅哌卡因對HuH7和人肝癌祖細胞的影響比對分化的人肝癌細胞影響更明顯。這可能是因為局麻藥對高增殖能力的細胞比低增殖能力細胞的作用更強。從機制上來說，局麻藥可能通過靶向某些促進腫瘤細胞增殖能力的信號通路或離子通道或受體發揮作用。

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，稱為集落或克隆。細胞集落形成實驗可以反應細胞的增殖能力。在我們的研究中，丁卡因以濃度依賴的方式抑制A375和B16的集落形成。我們發現0.05 mmol/L丁卡因能夠抑制A375和B16的集落形成能力，但此濃度的丁卡因對于A375和B16的細胞活力基本沒有明顯影響，這和此前報道的羅哌卡因在較低濃度時就表現出抑制腫瘤細胞增殖，但沒有細胞毒性作用相一致[15,16]。因此，不同濃度的丁卡因對黑色素瘤具有不同的抑制作用，在較低濃度主要表現為增殖抑制作用，在較高濃度則表現為直接的細胞毒性作用。

為進一步研究丁卡因在活體上對黑色素瘤的抑制作用，我們建立了小鼠皮下黑色素瘤模型，并通過腹腔注射丁卡因治療小鼠。結果顯示，丁卡因明顯抑制了小鼠皮下黑色素瘤的生長。但其對免疫的影響不清楚，其是否可以通過增強T細胞對腫瘤的殺傷作用也未知。實驗期間未觀察到小鼠出現明顯不良反應，腹腔注射丁卡因(20 mg/kg)對于BALB/c小鼠是一種可行的治療方式。綜上，丁卡因可能是一種有前景的抗黑色素瘤藥物。但目前關于其機制和臨床應用的研究有限，對于其機制和臨床應用的研究探索將有利于癌癥手術患者的預后。

Survivin，細胞凋亡抑制家族(IAPs)成員，是IAPs家族中抗凋亡能力最強的蛋白之一。Survivin在腫瘤中呈高表達且可以抑制腫瘤細胞的凋亡,從而促進腫瘤的發生、增殖及對化療的耐藥性[17]。Survivin的高表達是侵襲性和轉移性黑色素瘤的共有特征，在黑色素瘤細胞系中使用反義或顯性陰性突變體就足以引起細胞凋亡[18]。在本研究中，我們先發現了丁卡因使得黑色素瘤細胞A375和B16中Survivin的表達下調，追溯Survivin的上游蛋白MDM2發現其表達也下降，丁卡因可能是通過MDM2-Survivin通路介導黑色素瘤的死亡的。此外我們在小鼠皮下腫瘤模型得到了一致的結果：丁卡因抑制小鼠皮下黑色瘤的生長，丁卡因組瘤體組織Survivin蛋白表達減少。這說明，丁卡因發揮抗黑色素瘤的作用可能是通過MDM2下調Survivin表達實現的。

綜上所述，丁卡因在細胞水平及活體動物上都顯現出強有力的抗黑色素瘤(A375和B16)作用，這可能與其通過MDM2下調Survivin的表達相關。