環狀RNA circAKT3對骨肉瘤細胞生物學行為的影響

張開亮,韓 康,陳 明,信 波,李大河

(1 解放軍第960醫院泰安醫療區骨科,泰安 271000;2 空軍軍醫大學唐都醫院骨科;3 解放軍第960醫院濟南醫療區骨科;4 解放軍第960醫院泰安醫療區腫瘤科;*通訊作者,E-mail:bzmcldh@163.com)

作為最常見的惡性骨腫瘤之一,骨肉瘤主要發生于兒童和青少年[1,2]。骨肉瘤具有高度侵襲性,很容易出現早期轉移[3]。近年來,雖然新輔助療法和輔助化療已在臨床中廣泛使用,但是仍不能完全抑制腫瘤的生長,使骨肉瘤的死亡率依然處于較高水平[4]。因此,在針對骨肉瘤的治療中,迫切需要發掘新的治療手段和靶點。

環狀RNA(circular RNA, circRNA)是一類新的非編碼RNA分子,其廣泛存在于真核細胞的細胞質中[5]。不同于線性RNA分子,circRNA作為環狀閉合分子,具有高度的穩定性[6]。circRNA具有多種功能,例如調節剪接和轉錄,結合蛋白以及轉運RNA[7,8]。最近的研究表明,眾多circRNA在多種腫瘤中表達異常,且其異常表達與腫瘤的進展密切相關,在腫瘤中充當癌基因或抑癌基因[9]。作為circ-RNA家族中的一份子,circAKT3可促進胃癌和肺癌的進展[10,11]。在之前的研究中,我們在細胞層面證實,circAKT3可促進骨肉瘤U2OS細胞的增殖和抑制細胞凋亡[12]。骨肉瘤作為具有高度侵襲能力的惡性腫瘤,circAKT3是否可以抑制骨肉瘤侵襲和轉移,具有重要研究意義。除了在U2OS細胞系,在其他骨肉瘤細胞系是否具有同樣作用,且其在臨床層面是否同樣具有癌基因作用,都需要進一步去研究。本實驗就以上問題進行了驗證,旨在進一步明確circAKT3在骨肉瘤中的癌基因作用,也為臨床骨肉瘤的治療提供可靠有效的治療靶點。

1 方法和材料

1.1 臨床標本采集

2016年3月至2018年12月在唐都醫院骨科收集42例骨肉瘤組織標本以及10例相應瘤旁組織標本,術前均征得患者同意并簽署同意書,患者術前均未進行過放化療。標本取出后,立即放入-80 ℃進行保存。

1.2 細胞系及培養條件

骨肉瘤SOSP-9607細胞系由唐都醫院骨科建立,并在骨科骨腫瘤研究所進行保存[13]。U2OS細胞系購于ATCC(American type culture collection,美國模式培養物集存庫)。SOSP-9607細胞系采用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)進行培養,而U2OS細胞系則采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基(美國Hyclone公司)進行培養。所有細胞均在37 ℃、含有5% CO2濃度的飽和濕度的細胞培養箱(美國Thermo公司)內進行培養。

1.3 細胞轉染及分組

根據LipofectamineTM2000的操作手冊對骨肉瘤SOSP-9607和U2OS細胞的circAKT3 siRNA序列及siRNA NC(negative control)序列進行轉染,轉染均在6孔板(美國Corning公司)內進行。circAKT3的siRNA序列和siRNA NC序列購至廣東銳博生物科技有限公司。

后續將骨肉瘤細胞分為實驗組和對照組,實驗組細胞轉染circAKT3的siRNA序列,而對照組細胞則轉染siRNA NC序列。

1.4 qRT-PCR檢測骨肉瘤組織及細胞中circAKT3的表達水平

采用TRIzol溶液(美國Sigma公司)對骨肉瘤組織和細胞進行裂解,其中在SOSP-9607細胞轉染效率的驗證部分,在細胞轉染24 h后進行裂解。在獲取細胞和組織內的RNA后,采用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒進行反轉錄,從而獲得相應的cDNA。最后采用EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix試劑盒進行qPCR。引物序列如下:circAKT3上游5′-TCCAAATAAACGCCTTGGTGG-3′,下游5′-CCTCAGAGAACACCCGCTCT-3′;GAPDH上游5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,下游5′-ATCC-GTTGACTCCGACCTTCAC-3′。

1.5 CCK-8實驗檢測骨肉瘤細胞的增殖能力

待兩組細胞轉染24 h后,將細胞鋪于96孔板,每孔4 000細胞,每組每個時間點鋪8復孔,共鋪4板,分別用于鋪板后24,48,72,96 h的檢測。在檢測前,每孔加入10 μl CCK-8溶液(日本同仁公司),然后將孔板置于細胞培養箱1 h,最后上機檢測兩組細胞在450 nm波長處的光密度值(optical density,OD)。

1.6 流式細胞儀凋亡檢測實驗檢測骨肉瘤細胞的凋亡率

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶公司)進行檢測。待兩組細胞轉染48 h后,1 ml的1×Binding Buffer重懸細胞兩次,取100 μl細胞懸液加入實驗管中,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC溶液后,室溫下避光孵育10 min。每管中繼續添加5 μl PI溶液,室溫下避光孵育5 min。添加預冷PBS將每管補至500 μl后上機檢測。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測骨肉瘤細胞的侵襲能力

待Matrigel基質膠(美國BD公司)融化后,采用OPTI-MEM(美國Gibco公司)培養基進行1 ∶8稀釋,然后取50 μl稀釋后基質膠鋪于Transwell小室(美國Corning公司)內,全程在冰上進行,鋪膠后十字搖晃,以保證鋪膠均勻。然后將鋪膠后小室置于細胞培養箱中放置1 h,此時基質膠會發生凝固。

在細胞轉染48 h后,添加相應無血清培養基離心收集6孔板內實驗組和對照組細胞,計數3次,取平均值,然后將5×104細胞懸浮細胞添加至Trans-well小室內,并添加相應無血清培養基將小室內體積補至200 μl。然后在Transwell小室下孔板內添加600 μl含有20%胎牛血清的相應培養基。

在細胞培養箱培養20 h后,取出小室,棉簽去除基質膠,然后采用95%乙醇固定10 min,繼續采用0.5%結晶紫溶液染色5 min,最后在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.8 Transwell遷移實驗檢測骨肉瘤細胞的遷移能力

除了Transwell小室不鋪Matrigel基質膠,且在細胞培養箱培養12 h后即取出小室進行觀察外,余同Transwell侵襲實驗。

1.9 統計學分析

實驗結果采用SPSS 22.0軟件(美國IBM公司)進行統計分析,并采用GraphPad Prism 7.0進行作圖。計量資料采用均數±標準差表示。CCK-8實驗部分結果采用two-way ANOVA檢驗進行分析,42例患者骨肉瘤組織中circAKT3的表達水平與骨肉瘤臨床相關病理參數的相關性實驗部分結果采用Fisher確切概率法進行分析,10例骨肉瘤患者腫瘤及相應瘤旁組織中circAKT3表達水平檢測結果采用paired Student-t檢驗進行分析,余實驗結果采用two-tailed Student-t檢驗進行分析。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 circAKT3的siRNA在骨肉瘤SOSP-9607細胞中轉染效率的驗證

qRT-PCR實驗結果顯示,實驗組在轉染circAKT3的siRNA后,其細胞內circAKT3的表達水平較對照組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.001,見圖1),說明轉染有效,可以用于后續實驗。

2.2 抑制circAKT3的表達可抑制骨肉瘤SOSP-9607細胞的增殖能力

CCK-8結果顯示,實驗組在轉染siRNA抑制circAKT3的表達后,其細胞在72 h和96 h的增殖能力明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

與對照組比較,* * * P <0.001圖1 qRT-PCR檢測circAKT3 siRNA的轉染效果Figure 1 The transfection efficiency of siRNA against circAKT3 detected by qRT-PCR

與對照組比較,* P <0.05,* * * P <0.001圖2 CCK-8實驗檢測下調circAKT3對骨肉瘤細胞增殖的影響Figure 2 Effect of down-regulating circAKT3 on cell proliferation of osteosarcoma detected by CCK-8 assay

2.3 抑制circAKT3的表達可增加骨肉瘤SOSP-9607細胞的凋亡率

流式細胞儀凋亡檢測實驗結果顯示,實驗組細胞的凋亡率較對照組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.001,見圖3)。

2.4 下調circAKT3表達可抑制骨肉瘤SOSP-9607和U2OS細胞的侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果表明,實驗組在下調SOSP-9607和U2OS細胞內circAKT3的表達后,細胞的侵襲能力較對照組也明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01,見圖4)。

2.5 下調circAKT3表達可抑制骨肉瘤SOSP-9607和U2OS細胞的遷移能力

Transwell遷移實驗的結果同Transwell侵襲實驗一致,較之對照組,實驗組細胞的遷移能力明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01,見圖5)。

與對照組比較,* * * P <0.001圖3 流式細胞儀檢測下調circAKT3對骨肉瘤細胞凋亡的影響Figure 3 Effect of down-regulating circAKT3 on osteosarcoma cell apoptosis detected by flow cytometry

圖4 Transwell侵襲實驗檢測下調circAKT3對骨肉瘤細胞侵襲的影響Figure 4 Effect of down-regulating circAKT3 on osteosarcoma cell invasion evaluated by Tranwell invasion assay

圖5 Transwell遷移實驗檢測下調circAKT3對骨肉瘤細胞遷移的影響Figure 5 Effect of down-regulating circAKT3 on osteosarcoma cell migration evaluated by Tranwell migration assay

2.6 circAKT3在骨肉瘤組織中表達明顯增高

對10對骨肉瘤組織及相應的瘤旁組織進行circAKT3表達水平進行檢測,結果顯示,骨肉瘤組織中circAKT3的表達水平較瘤旁組織明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01,見圖6)。

2.7 circAKT3表達水平與骨肉瘤臨床相關病理參數的相關性

實驗選擇42例骨肉瘤組織進行了circAKT3表達水平的檢測,以其表達水平的平均值為標準,將其分為circAKT3高、低表達組,并分析了circAKT3的表達水平與骨肉瘤患者的年齡、性別、分期、大小及是否有轉移等相關臨床病理參數的關系。結果顯示,circAKT3的表達水平與骨肉瘤患者的臨床分期和轉移呈正相關,即骨肉瘤高臨床分期和發生轉移患者的骨組織中circAKT3的表達水平更高(P<0.05,見表1)。

與瘤旁組織比較,* * P <0.01圖6 qRT-PCR檢測骨肉瘤及瘤旁組織中circAKT3的表達水平Figure 6 The expression of circAKT3 in osteosarcoma and adjacent tissues detected by qRT-PCR

表1 骨肉瘤患者的circAKT3表達水平與臨床相關病理參數的相關性

3 討論

隨著circRNA在腫瘤中的研究已成為熱點,越來越多的circRNA被證實參與了腫瘤的發生和發展,成為腫瘤治療的潛在新的靶點,為腫瘤的治療提供了新的思路[14]。日益增多的研究表明,circRNA在骨肉瘤中同樣也作為腫瘤發生和發展的重要參與者。例如,circMYO10在骨肉瘤中高表達,其作為癌基因可促進骨肉瘤增殖、侵襲和遷移[15]。此外,circ-0100876在骨肉瘤中表達被抑制,低表達的circ-0100876在骨肉瘤中作為抑癌基因可抑制骨肉瘤的惡性生物學行為[16]。而在之前的研究中,circ-AKT3被證實可促進骨肉瘤U2OS細胞的增殖和抑制細胞凋亡[12]。本實驗同樣證實了circAKT3可以促進SOSP-9607細胞的增殖和抑制細胞凋亡,證實了circAKT3在骨肉瘤細胞系中作用具有一定普遍性。骨肉瘤作為高度侵襲性惡性腫瘤,很多患者在就診時已經出現轉移,如何抑制骨肉瘤轉移具有重要現實意義。在本實驗中,我們在SOSP-9607和U2OS細胞系中證實了circAKT3可促進骨肉瘤的侵襲和遷移,是骨肉瘤促轉移的參與者。綜上,我們在細胞層面證實了circAKT3在骨肉瘤增殖、凋亡、侵襲和遷移等多個生物學行為中的促進作用。

除了在細胞層面,實驗在臨床標本層面證實了骨肉瘤中circAKT3的表達水平明顯高于其瘤旁組織,同樣提示了circAKT3在臨床中的癌基因潛質。后續通過分析42例骨肉瘤患者組織中circAKT3的表達水平,結果表明,circAKT3的表達水平與骨肉瘤的臨床分期以及轉移事件的發生呈正相關,明確了circAKT3在骨肉瘤臨床中的癌基因角色。需要看到的是,雖然circAKT3在細胞層面可促進細胞增殖,但是在此次臨床樣本統計中,其高表達與腫瘤大小的差異無明顯關系。考慮其一可能是樣本例數不足,未能準確反映其相關性;其二可能受骨肉瘤患者的就診時間影響較大,以致臨床很難準確反映兩者的相關性。綜上,臨床層面的研究結果同細胞層面研究基本相一致,都證實了circAKT3在骨肉瘤中的促進作用,兩者的一致性,也證實了研究的可靠性。

隨著對circRNA的研究日益深入,關于其下游作用機制的研究也越發深入。大量的miRNA被證實為circRNA的下游靶點,circRNA通過海綿吸附miRNA的作用已被廣泛報道。例如,circ-0060428通過海綿吸附miR-375進而解除后者對基因RBPJ的抑制作用,最終促進骨肉瘤的進展[17]。同樣,circHIPK3通過作用于miR-637/STAT3軸進而促進骨肉瘤轉移[18]。而circAKT3是否同其他很多circ-RNA一樣存在下游miRNA,需要進一步研究。

綜上,在前期研究的基礎上,本實驗進一步在細胞層面證實了circAKT3可促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和抑制凋亡,此外,在臨床標本層面中,骨肉瘤中circAKT3的表達水平與骨肉瘤的臨床分期和轉移事件發生呈正相關。本研究進一步證實了circAKT3在骨肉瘤中的癌基因角色,為骨肉瘤的臨床治療提供了潛在有效的治療靶點。