五味子酯甲抑制頭頸癌HN4細胞增殖和誘導凋亡的機制研究

曹祥燎,張 路,錢 峰,2*

(1 蚌埠醫學院癌癥轉化醫學安徽省重點實驗室,蚌埠 233000;2 上海交通大學藥學院;*通訊作者,E-mail:fengqian@sjtu.edu.cn)

頭頸癌是發生在頭頸區域的腫瘤,是當今世界上第七大最常見的癌癥。目前常見的治療方法包括手術、放療、化療、免疫治療和聯合治療[1,2],由于其存在復發、轉移,5年存活率僅為50%左右[3]。雖然以西妥昔單抗和派姆單抗為主的分子靶向表皮生長因子受體治療提高了生存率,預后仍沒有得到較好的結果[4,5]。由于頭頸癌的耐藥性和致病機制的復雜性,因此有必要尋找有效的信號通路和靶點來治療[6,7]。

目前大部分化療藥物是通過誘導細胞凋亡阻滯細胞生長和促進腫瘤凋亡[8]。細胞凋亡主要有兩種凋亡途徑:固有凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑。固有凋亡途徑由多種細胞內和細胞外壓力激發,線粒體接受到刺激后,膜電位降低,細胞色素c釋放,形成凋亡小體,活化半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成員凋亡啟動者Caspase-9以及凋亡執行者Caspase-3,剪切凋亡核心成員PARP促進凋亡發生。死亡受體凋亡途徑由腫瘤壞死因子受體相關凋亡誘導配體受體(TRAIL-R)活化產生,DR4和DR5是TRAIL-R的成員,位于細胞膜上,胞內含有死亡受體區域,可接受腫瘤壞死因子受體相關凋亡誘導配體(TRAIL)等影響因素刺激后,形成死亡誘導信號復合物,活化Caspase-8,下游導致一系列caspase級聯反應,包括對Caspase-9,Caspase-3的剪切來促進凋亡發生[9,10]。目前發現合成或者天然化合物可以通過增加TRAIL、DR4和DR5蛋白等活化死亡受體途徑誘導凋亡,而且拮抗頭頸癌細胞的抗DR4單克隆抗體AY4或rhTRAIL顯示出了良好的抗腫瘤效果[11,12]。因此,發展有效靶向TRAIL信號通路的候選藥物對臨床上治療頭頸癌顯示出良好的前景。

五味子酯甲,是從五味子中分離出來的一種主要的生物活性木子素[13],是一種用于止咳、鎮靜的中國傳統藥物[14]。近年來藥理特性研究發現其在肝腎缺血再灌注損傷,腦神經炎性和誘導的細胞炎性反應等有保護作用[15-17];同時也有研究顯示了五味子酯甲在腫瘤中發揮良好的抗腫瘤特性,能夠有效地誘導胃癌細胞凋亡的發生[18]。但是,五味子酯甲在頭頸癌的抗腫瘤活性和作用機制尚不清楚,本研究的目的是探討五味子酯甲對頭頸癌細胞(HN4)的影響及其可能的作用機制,為頭頸癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試劑

人頭頸癌舌部鱗狀上皮細胞HN4購自美國ATCC公司,培養于蚌埠醫學院癌癥醫學轉化中心實驗室。RPMI-1640培養基,胰蛋白酶(含EDTA),雙抗(青霉素/鏈霉素)購自美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司;二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO),增強的化學發光底物ECL購自美國賽默飛公司;CCK-8溶液,BCA蛋白檢測試劑盒,磷酸鹽緩沖水溶液購自上海碧云天公司;4%組織細胞固定液,1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.8),1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=6.8),10% SDS購自北京索萊寶科技有限公司;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA),RNA酶,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)購自美國Sigma公司;雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)購自杭州聯科生物公司;化合物五味子酯甲(schisantherin A)購自上海陶素生物科技有限公司;藥物溶解在DMSO中,瑞氏-吉姆薩染液購自南京建成科技公司,Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、Cleaved PARP、GAPDH蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養

人頭頸癌細胞HN4培養在含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖

取對數生長期生長狀態良好的人頭頸癌細胞HN4,胰酶消化得單細胞懸液,離心,棄上清,再加入RPMI-1640完全培養基重懸細胞,計數取5×102個/孔細胞接種于6孔板中,每孔依次加入0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 μmol/L的五味子酯甲溶液。將6孔板放置37 ℃,5% CO2培養箱中持續培養7 d,直到對照組單細胞形成的細胞克隆數大于200個時,終止培養。棄培養液,用預先冷卻的PBS溶液清洗2次細胞后,每孔加1 ml甲醇固定30 min,棄甲醇。向每孔滴加0.8 ml瑞氏-吉姆薩染色液試劑一,覆蓋孔底部,染色20 min,再滴加1.6 ml瑞氏-吉姆薩染色液試劑二,充分混勻試劑一后,染色20 min,棄染液。用自來水清洗3次,晾干并拍照。計算6孔板每孔的細胞克隆數目,計算克隆增殖率,計算公式為:克隆增殖率=加藥組孔克隆數/對照組孔克隆數×100%。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞毒性

取對數生長期生長狀態良好的人頭頸癌細胞HN4,計數取5×103個/孔細胞接種于96孔板中,待細胞貼壁后,每孔依次加入0,0.05,0.1,0.5,1,2.5 μmol/L五味子酯甲溶液,將96孔板放置37 ℃,5% CO2培養箱培養24 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續培養2 h,酶標儀分光度450 nm處測OD值,計算細胞在不同濃度的五味子酯甲時的細胞活力:細胞活力(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.5 PI染色檢測細胞周期

取對數生長期生長狀態良好的人頭頸癌HN4細胞,計數取5×105個/孔細胞接種于12孔板中,待細胞貼壁,融合度達到90%左右時換液,每孔依次加入0,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲溶液,將12孔板放置37 ℃,5% CO2培養箱培養24 h。棄上清收集細胞于流式管中,用預先冷卻的PBS溶液清洗2次后,0.4 ml的PBS溶液重懸細胞,加入到預先冷卻的70%乙醇中4 ℃冰箱避光固定過夜,取出離心棄上清,0.4 ml的PBS溶液重懸細胞沉淀,加入10 μg/ml的RNase室溫靜置30 min,再加入50 μg/ml的PI染料染色10 min,Beckman CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司)檢測細胞周期分布狀況,用數據處理軟件分析細胞周期分布。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

取對數生長期生長狀態良好的人頭頸癌HN4細胞,用不同濃度的五味子酯甲(0,0.25,0.5,1 μmol/L)處理HN4細胞24 h。收集上清和相對應管的細胞于同一流式管中,離心后PBS溶液清洗2次,每管加入0.4 ml的1×Annexin Ⅴ-FITC結合液混懸沉淀,從不同濃度管中分別取60 μl細胞懸液組成一管,組成三管作雙陰組,Annexin Ⅴ/FITC單染組和PI單染組作對照管,實驗管每管加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI染色液避光染色20 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、GAPDH蛋白表達

不同濃度的五味子酯甲溶液(0,0.25,0.5,1 μmol/L)處理HN4細胞24 h,胰酶消化,離心得到細胞沉淀,PBS溶液清洗2次,在冰上加入PIPA細胞裂解液裂解30 min,收集細胞總蛋白,BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min。每組取30 μg蛋白,10% SDS-PAGE電泳(80 V,30 min;110 V,100 min);轉膜(200 mA,2 h)至NC膜;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;用一抗稀釋液1 ∶1 000稀釋的抗體Cyclin B1、P21、DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、GAPDH在4 ℃孵育過夜;TBST洗滌3次,7 min/次;用二抗稀釋液1 ∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G(H+L)二抗抗體避光敷育2 h;TBST洗滌3次,7 min/次;ECL發光試劑盒檢測蛋白發光,使用儀器Tanon-5200(上海天能科技有限公司)截取圖像。

1.8 統計學方法

使用GraphPad Prism 5軟件對數據進行統計學分析,實驗數據以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)和Tukey檢驗,兩組間比較采用非配對樣本t檢驗,以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五味子酯甲對HN4細胞的增殖抑制作用

克隆形成結果顯示,HN4細胞經過不同濃度的五味子酯甲處理7 d,隨著五味子酯甲濃度升高,細胞克隆形成數量明顯減少。0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 μmol/L五味子酯甲組克隆形成率分別為(96.11±1.16)%,(62.00±5.73)%,(36.66±1.58)%,(10.00±2.9)%,0%,與0 μmol/L組相比,差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

2.2 五味子酯甲對HN4細胞的細胞毒性作用

用不同濃度五味子酯甲處理HN4細胞24 h,發現細胞存活率隨著五味子酯甲濃度升高而下降。0.05,0.1,0.5,1,2.5 μmol/L五味子酯甲組細胞存活率分別為(90.37±8.16)%,(84.55±8.97)%,(64.02±5.43)%,(60.73±1.97)%,(57.54±0.57)%,與0 μmol/L組相比,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

圖1 五味子酯甲抑制HN4細胞克隆形成Figure 1 The inhibitory effects of schisantherin A on the colony formation of HN4 cells

圖2 五味子酯甲對HN4細胞的細胞毒性作用Figure 2 The cytotoxic effects of schisantherin A on HN4 cells

2.3 五味子酯甲對HN4細胞周期的影響

PI染色結果顯示,不同濃度五味子酯甲作用HN4細胞24 h能顯著誘導細胞S期和G2/M期阻滯。0,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲組在S期細胞分布比例為(8.47±2.97)%,(11.23±2.62)%,(40.7±2.94)%,(28.87±1.27)%;在G2/M期細胞分布比例為(7.9±0.86)%,(10.47±0.68)%,(24.4±0.69)%,(36.7±3.7)%;0.25,0.5,1 μmol/L組與0 μmol/L組相比,差異均有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

圖3 不同濃度五味子酯甲處理24 h對HN4細胞周期影響Figure 3 Effect of schisantherin A on cell cycle of HN4 cells after treatment for 24 h

2.4 五味子酯甲對細胞周期相關蛋白Cyclin B1、P21表達的影響

Western blot結果顯示,與0 μmol/L相比,0.25,0.5,1 μmol/L五味子酯甲作用HN4細胞24 h,細胞的Cyclin B1、P21蛋白表達量明顯增加(P<0.05,見圖4)。

2.5 五味子酯甲對HN4細胞凋亡的影響

細胞凋亡實驗結果顯示,用不同濃度五味子酯甲作用于HN4細胞24 h,隨著藥物濃度增加細胞凋亡率也增加。0.25,0.5,1 μmol/L的五味子酯甲三組細胞凋亡率為(13.03±0.74)%,(35.67±15.83)%,(67.8±4.57)%,與0 μmol/L組[(5.33±1.3)%]相比,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 五味子酯甲對細胞凋亡相關蛋白和DR4/DR5蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與0 μmol/L相比,0.25,0.5,1 μmol/L的五味子酯甲作用于人頭頸癌HN4細胞24 h,細胞的DR5、DR4、cleaved Caspase-9、cleaved RARP蛋白表達量明顯上調(P<0.05,見圖6)。

圖4 免疫印跡法檢測五味子酯甲對HN4細胞Cyclin B1和P21蛋白表達的影響Figure 4 Effect of schisantherin A on the protein expression of Cyclin B1 and P21 in HN4 cells by Western blot

圖5 不同濃度五味子酯甲處理24 h對HN4細胞凋亡的影響Figure 5 Effect of schisantherin A on the apoptosis of HN4 cells after treatment for 24 h

圖6 免疫印跡法檢測不同濃度五味子酯甲對HN4細胞DR5、DR4、Cleaved Caspase-9、cleaved PARP蛋白表達的影響Figure 6 Effect of schisantherin A on the expression of DR5, DR4, cleaved Caspase-9, cleaved PARP in HN4 cells by Western blot

3 討論

頭頸癌作為異質性腫瘤,發病位點較多,發病機制復雜。雖然治療方法有所改進,但治療效果不太理想,過去幾十年的頭頸癌生存率并沒有明顯提高。因此,尋找新的藥物及有效機制誘導細胞凋亡成為治療頭頸癌的一個重要方向。五味子酯甲是一種活性很強的單體化合物,以往的研究主要是圍繞化合物的抗炎性和抗損傷作用展開,而本研究探究其對頭頸癌細胞的抗癌作用效果。研究結果顯示,五味子酯甲能抑制細胞增殖和減少細胞克隆數目,能誘導HN4細胞S期和G2/M期阻滯和調控細胞周期蛋白Cyclin B1以及P21表達的增加,也能誘導caspase依賴性的凋亡和調控死亡受體蛋白DR5以及DR4的表達增加。

由于癌細胞的快速增殖特性,靶向細胞周期成為抗癌藥物治療的有效策略[19]。p21是細胞周期依賴性激酶抑制劑,在細胞周期兩個主要檢查點G1/S期和G2/M期均能發揮周期抑制作用[20]。p21可與Cyclin B1-CDC2復合物結合后,促使細胞G2/M期阻滯,漢防己甲素(tetrandrine)可通過增加P21蛋白表達使胰腺癌PANC-1和BxPC3細胞G2/M期阻滯和增殖抑制[21],重樓皂甘(polyphyllin G)通過增加P21和減少Cyclin B1的表達促使頭頸癌OCEM-1細胞G2/M期阻滯[22]。而本研究中發現五味子酯甲作用頭頸癌HN4細胞除了P21蛋白表達增加和G2/M期阻滯外,Cyclin B1蛋白表達增加和細胞S期阻滯,顯示了與重樓皂甘作用于頭頸癌細胞的不同結果,可能與其他調控機制有關。

相比于傳統藥物的細胞毒性和腫瘤耐受,TRAIL通過促凋亡蛋白DR5和DR4的表達選擇性誘導凋亡且對正常細胞沒有毒性,顯示了良好的治療前景。研究發現,土荊乙酸(pseudolaric acid B)通過增加DR5蛋白和激活下游caspase信號通路抑制頭頸癌HN22細胞增殖和促進細胞凋亡,同時體內實驗也顯示化合物有效抑制腫塊生長且沒有器官損害和體重減輕等副作用[23],8-羥基喹啉通過促進DR5和DR4蛋白同時表達和增加細胞內氧化水平來增加頭頸癌SCC25細胞凋亡[24],表明化合物可以有效地通過增加死亡受體蛋白DR4和DR5表達誘導頭頸癌細胞凋亡。也有研究顯示,由于不同腫瘤中DR4和DR5的表達水平不同,因而抗DR4或抗DR5抗體作用腫瘤后凋亡水平也有差異,由于頭頸癌細胞HN6和OSCC3表面DR4蛋白含量較低使TRAIL誘導凋亡水平較低[12],而同時抗DR4和DR5的重組抗體rhTRAIL能最大限度地激活死亡受體途徑,促進腫瘤凋亡[25]。本研究結果顯示五味子酯甲能同時誘導DR5和DR4的表達,通過線粒體途徑的Caspase-9蛋白剪切,引起caspase級聯反應以及凋亡核心蛋白RARP的剪切誘導凋亡發生,表明了死亡受體蛋白DR4和DR5是五味子酯甲抑制頭頸癌的有效靶點。

天然化合物具有較強的生物活性,因其安全、較少的毒性作用、抗氧化、易獲得性等原因,成為獲取化療藥物的理想來源[26]。目前天然化合物在治療癌癥中顯示了良好的效果,姜黃素可以通過靶向pSTAT3和Nrf-2信號通路輔助順鉑對頭頸癌治療效果,且能減少順鉑治療相關的耳毒性不良反應[27]。五味子酯甲作為從植物中提取出來的天然化合物,近年來研究中顯示了一系列藥理活性作用[28]。五味子酯甲能通過阻斷MAPK和NF-κB信號通路發揮抗IL-1β刺激的軟骨細胞的炎性作用,也能通過阻斷MAPK信號通路來減輕肝缺血再灌注損傷[15-17],也有研究顯示,五味子酯甲通過MAPK信號通路發揮了抗腫瘤效果,在胃癌中通過活化JNK信號通路促進細胞周期G2/M阻滯和誘導細胞凋亡發生,且在作用濃度內對巨噬細胞樣細胞Raw264.7的增殖沒有顯著影響[18],提示五味子酯甲在較低濃度范圍內的藥理活性,且較低作用濃度對正常細胞沒有損傷。因此五味子酯甲以其多種藥理活性和低毒副作用的特性,為其成為理想的化療藥物提供了可能。

綜上所述,本研究結果表明五味子酯甲具有抑制頭頸癌HN4細胞增殖,誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡的作用;其機制可能與caspase級聯反應的激活和DR5與DR4相關的死亡受體途徑通路的激活有關。本研究顯示了五味子酯甲具有治療頭頸癌的作用,為進一步探究五味子酯甲抗癌治療提供了依據,但詳細機制有待進一步的實驗證明。