內質網應激在同型半胱氨酸調控巨噬細胞向泡沫細胞轉化中的作用

李 煒,劉 靜,郭 麗,廉 誠,高 釗,樊貝貝,張曉東,靳 強,張艷濤,孫夢娜,曾廣偉*

(1 西安國際醫學中心醫院心臟病醫院心臟內科,西安 710100;2 空軍軍醫大學第二附屬醫院心臟內科;3 空軍軍醫大學第一附屬醫院老年科;*通訊作者,E-mail:zengguangwei1026@163.com)

巨噬細胞作為重要的免疫細胞,能分泌大量的炎性因子,在動脈粥樣硬化的發生發展中起關鍵作用。巨噬細胞主要參與Th1細胞介導的炎癥反應,在釋放的多種炎癥因子和趨化因子作用下,吞噬大量脂質,形成泡沫細胞,并在動脈內膜聚集[1]。泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化病變發生早期的標志性事件[2]。內皮細胞也可以分化為平滑肌樣細胞,這些細胞可能參與并促進動脈粥樣硬化性血管重塑[3]。此外,血管平滑肌細胞可分化為巨噬細胞,在脂質攝取后形成泡沫細胞[4]。

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是心血管疾病的獨立危險因素,能通過多種炎癥因子促進動脈粥樣硬化的發生發展。實驗動物模型和臨床研究均表明內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)主要參與了動脈粥樣硬化晚期斑塊的發展過程[5],但在早期泡沫細胞形成中的作用還有待闡明。巨噬細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞在動脈粥樣硬化時其ERS相關蛋白的表達增高,最終導致細胞凋亡[6]。然而,ERS在Hcy加重氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)誘導巨噬細胞向泡沫細胞轉化中的作用還不清楚。本研究采用Thp-1細胞源性巨噬細胞,觀察ERS在同型半胱氨酸加重oxLDL誘導巨噬細胞向泡沫細胞轉化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養基購自美國Gibco技術公司;蘇木素購自南京建成生物科技公司;佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司;膽固醇定量試劑盒購于美國Biovision公司;BCA蛋白定量試劑盒購于西安晶彩生物科技有限公司;NEAA細胞培養添加物購于賽業生物技術公司;油紅O染液購自南京建成生物科技公司;人oxLDL-c購自廣州奕源生物科技公司。GRP78和GRP94抗體購于Abcam公司;山羊抗鼠及山羊抗兔抗體購于西安中杉生物科技有限公司。

1.2 細胞培養和傳代

將購買的Thp-1細胞復蘇,用含有Gluta-MAX、1% NEAA和10% FBS的RPMI-1640培養基,并置于37 ℃、5% CO2的恒溫孵箱中培養。根據細胞生長情況定期換液。細胞靜置12 h,將多余的培養基吸出棄掉后,吸入離心管中常溫下1 000g離心5 min后棄去上清并加入培養基重懸,分別種入不同的培養瓶中。

1.3 實驗分組

Thp-1細胞是人白血病細胞來源的單核細胞系,經PMA誘導后可分化為巨噬細胞。為了觀察Hcy調控巨噬細胞向泡沫細胞轉化以及探討ERS在其中發揮的作用,將密度合適的Thp-1細胞被隨機分為:對照組(control)、oxLDL組、Hcy+oxLDL組和4-PBA組。control組細胞在正常培養基中培養;oxLDL組細胞在培養基中加入50 μg/ml oxLDL-c和Thp-1細胞共培養;Hcy+oxLDL組細胞培養基中加入50 μg/ml oxLDL-c和100 μmol/L Hcy和Thp-1細胞共培養;4-PBA組細胞先用5 mmol/L4-PBA處理細胞30 min,再與50 μg/ml oxLDL-c和100 μmol/L Hcy共培養。采用油紅O染色檢測脂質沉積,ELISA試劑盒檢測膽固醇含量,RT-PCR檢測GRP78和GRP94的mRNA水平,Western blot檢測GRP78和GRP94蛋白表達的變化。

1.4 巨噬細胞脂質染色

Thp-1來源的巨噬細胞貼壁生長后,用預冷的PBS洗滌細胞2次,4%多聚甲醛固定10 min,用60%的異丙醇洗滌細胞2次,加入配制好的油紅進行染色,室溫下染色1 min,用60%的異丙醇洗滌細胞2次,每次10 s,再用PBS洗滌細胞2次,每次10 s,蘇木素復染細胞核,室溫下處理30 s,用PBS洗滌細胞3次,置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 巨噬細胞膽固醇含量測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定Thp-1來源的巨噬細胞內膽固醇含量。方法如下:將培養基倒掉后,加入PBS輕輕吹打細胞,使貼壁的細胞重新懸浮后,使用超聲將細胞破碎。使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白定量后,按照說明進行操作:每組樣本取200 μl和濃度為15%的KOH/乙醇2 ml進行混合,置于70 ℃水浴鍋中反應1 h后,迅速降至室溫,加入雙蒸水1 ml后,再加入正己烷2.4 ml,異丙醇0.6 ml,振蕩器上震蕩10 min充分混勻后,3 500g離心5 min后去上清,用40 ℃氮氣干燥12 h。所得固體加入100 μl甲醇溶解,震蕩混勻后用波長為216 nmol/L進行檢測。

1.6 RT-PCR檢測GRP78和GRP94的mRNA水平

用RNA分離試劑盒分離總RNA,并使用Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA。用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix進行qPCR擴增反應。以下引物(購于中國上海)用于RT-PCR:GRP78正義鏈5′-GATTGGACAAGAGAGAGGGTGA -3′,反義鏈5′-CCATAACACGCTGGTCAAAGTC-3′;GRP9正義鏈5′-CAGTTGGATGGGTTAAACGCA-3′,反義鏈5′-TTCCAGCGAGTGCATTTTCAT-3′;GAPDH正義鏈5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,反義鏈5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。GAPDH作為內參對照。使用ΔΔCt方法進行相對定量。

1.7 Western blot檢測大鼠主動脈血管中GRP78和GRP94的表達

將血管放入EP管中,加入RIPA裂解液并用眼科剪在冰上剪碎裂解30 min,4 ℃,12 000g離心10 min,取上清液并加入上樣緩沖液,沸水煮10 min,分裝并凍存于-80 ℃冰箱;10% SDS-PAGE膠每孔上樣20 μg,恒壓100 V電泳90 min,恒壓90 V濕轉2 h將蛋白轉移至硝酸纖維素膜,將膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,將膜放入GRP78(1 ∶1 000)和GRP94(1 ∶1 000)一抗中4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,將膜和相應二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,ECL化學發光,Image圖像分析軟件分析條帶灰度。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 PMA誘導Thp-1細胞分化為M2巨噬細胞

正常Thp-1細胞大多呈圓球形,在培養基中懸浮生長,部分細胞可以聚集在一起形成葡萄樣;加入200 nmol/L的PMA 12 h后,光學顯微鏡下觀察可見細胞由懸浮轉為貼壁生長,細胞形態由圓球形變為多角梭形或不規則形,部分伸出偽足(見圖1)。CD163是巨噬細胞的標志物,提取懸浮生長的Thp-1細胞和分化后貼壁生長細胞mRNA后,RT-PCR方法檢測其表達,觀察到貼壁生長的細胞CD163表達明顯高于懸浮細胞(P<0.05,見圖1),這些結果表明PMA誘導Thp-1細胞分化為巨噬細胞。

圖1 Thp-1細胞分化為M2巨噬細胞 (×200)Figure 1 THP-1 cells differentiate into M2 macrophages (×200)

2.2 Hcy加劇M2型巨噬細胞分化為泡沫細胞

經油紅O和蘇木素染色后,光學顯微鏡下可以觀察到,control組細胞內少量顆粒狀脂質沉積,加入oxLDL-c的細胞內有部分顆粒狀脂質沉積,而加入oxLDL-c和Hcy處理的巨噬細胞可見大量紅色顆粒樣脂質沉積(見圖2)。oxLDL+Hcy組巨噬細胞轉化為泡沫細胞陽性率明顯高于oxLDL組(見圖2)。這一結果提示Hcy可以明顯促進巨噬細胞中的脂質積累并將其轉化為泡沫細胞。

脂質被油紅O和蘇木素染色為紅色顆粒;與control組對比,* P <0.05;與ox-LDL組相比,#P <0.05圖2 光鏡下Thp-1細胞來源巨噬細胞進行油紅O和蘇木素染色結果 (×200)Figure 2 Oil red O and hematoxylin staining of Thp-1 cell-derived macrophages under light microscope (×200)

2.3 Hcy增加巨噬細胞膽固醇含量

為了進一步證明Hcy對巨噬細胞脂質的累積作用,本實驗采用HPLC法檢測了膽固醇的含量。結果顯示,與control組相比,oxLDL組巨噬細胞膽固醇含量明顯升高(P<0.05);而與oxLDL組相比,Hcy+oxLDL組巨噬細胞膽固醇含量進一步增加(P<0.05,見圖3)。

與control組相比,* P <0.05;與oxLDL組相比,#P <0.05圖3 各組巨噬細胞膽固醇含量Figure 3 The cholesterol content of macrophages in each group

2.4 Hcy上調內質網應激標志物GRP78和GRP94的mRNA水平

與control組相比,oxLDL組巨噬細胞中GRP78和GRP94的mRNA水平升高(P<0.05);與oxLDL組比較,Hcy+oxLDL組巨噬細胞中GRP78和GRP94的mRNA水平進一步升高(P<0.05,見圖4)。

2.5 Hcy上調GRP78和GRP94蛋白表達

除了mRNA水平外,本實驗又采用Western blot檢測了GRP78和GRP94蛋白水平的變化。Western blot結果顯示,與control組相比,oxLDL組巨噬細胞中GRP78和GRP94蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);與oxLDL組比較,Hcy+oxLDL組巨噬細胞中GRP78和GRP94的蛋白表達進一步升高,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

與control組相比,* P <0.05;與oxLDL組相比,#P <0.05圖4 Hcy對巨噬細胞內質網應激分子GRP78和GRP94 mRNA的表達的影響Figure 4 Effect of Hcy on mRNA levels of endoplasmic reticulum stress molecules GRP78 and GRP94 in macrophages

與control組相比,* P <0.05;與oxLDL組相比,#P <0.05圖5 Hcy對巨噬細胞內質網應激分子GRP78和GRP94蛋白的表達的影響Figure 5 Effect of Hcy on protein expression of endoplasmic reticulum stress molecules GRP78 and GRP94 in macrophages

2.6 4-PBA抑制巨噬細胞攝取脂質

4-PBA是一種低分子量脂肪酸化合物,具有分子伴侶樣活性,是一種特異的內質網應激抑制劑。油紅O和蘇木素染色結果顯示:control組細胞內少量顆粒狀脂質沉積;加入oxLDL-c和Hcy后細胞內可見大量顆粒樣脂質沉積;4-PBA組的細胞脂質顆粒明顯減少,只有部分顆粒狀脂質沉積(見圖6)。與control組相比,Hcy+oxLDL組巨噬細胞膽固醇含量升高(P<0.05),與Hcy+oxLDL組相比,4-PBA組巨噬細胞膽固醇含量降低(P<0.05,見圖6)。

與control組相比,* P <0.05;與Hcy+oxLDL組相比,#P <0.05圖6 4-PBA對細胞膽固醇蓄積的影響 (×200)Figure 6 Effect of 4-PBA on cholesterol accumulation (×200)

3 討論

動脈粥樣硬化斑塊破裂導致的心臟急性缺血及腦栓塞是當前全球病死的首要原因[7]。單核細胞或巨噬細胞侵入血管內皮下聚集,并攝取脂質轉化為泡沫細胞在動脈粥樣硬化發生發展的過程中發揮了重要作用[8]。高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因素[9]。然而,HHcy在脂質代謝紊亂中的具體機制還不清楚。本實驗在細胞水平證實,單核細胞來源的M2巨噬細胞在Hcy的作用下經油紅O和蘇木素染色顯示細胞內大量紅色顆粒狀物質,膽固醇含量測定證實胞質內蓄積了大量的膽固醇,說明Hcy可以誘導巨噬細胞轉化為泡沫細胞,這可能是Hcy致血管損傷的機制之一,但是其影響巨噬細胞內膽固醇蓄積的機制還需要進一步闡明。

內質網是細胞內重要的細胞器,負責蛋白質折疊、翻譯后修飾和分泌,以及膜蛋白的轉運,維持細胞穩態[10]。當蛋白質折疊錯誤或未折疊蛋白質增多,引起未折疊蛋白反應,減少蛋白的合成,引起內質網應激。而GRP78和GRP94是內質網應激的標志性蛋白[11]。眾所周知內質網應激參與多種疾病的發生發展過程,但在Hcy導致巨噬細胞轉化為泡沫細胞過程中是否發揮作用還不清楚。在本實驗中,我們觀察到,Hcy組GRP78和GRP94表達明顯高于oxLDL組,提示在泡沫細胞中發生了內質網應激。但是否影響巨噬細胞對膽固醇的攝取仍有待闡明。

為了進一步證實內質網應激調控巨噬細胞轉化為泡沫細胞,我們應用了內質網應激抑制劑4-PBA。4-PBA是一種低分子量、無毒的脂肪酸,已被發現具有分子伴侶樣活性,其理化性質可以穩定肽結構,減少ER應激過程中保留在細胞中的突變蛋白或未折疊蛋白的數量,并作為分子伴侶發揮抗炎作用,其被認為是一種特異的內質網應激抑制劑[12]。本實驗觀察到油紅O和蘇木素染色后對照組的細胞內少量顆粒狀脂質沉積,加入oxLDL-c和Hcy作用的細胞染色見大量顆粒樣脂質沉積,4-PBA組細胞脂質顆粒明顯減少,只有部分顆粒狀脂質沉積。與Hcy+oxLDL組相比,4-PBA組細胞膽固醇含量降低,說明抑制內質網應激可以減少巨噬細胞對脂質的攝取,進而阻止其轉化為泡沫細胞,證實Hcy致血管損傷的機制之一是通過內質網應激途徑調控巨噬細胞轉化為泡沫細胞。已有研究表明,在同型半胱氨酸血癥大鼠中,激活單核細胞趨化因子、血管細胞黏附分子和E-選擇素可以引起單核細胞/巨噬細胞和動脈內皮細胞的黏附,增加動脈壁浸潤,促進動脈粥樣硬化的發展[13]。綜合本實驗在細胞水平的結果,我們猜測在體水平Hcy也可通過ERS調控巨噬細胞向泡沫細胞轉化并在動脈粥樣硬化的發生發展中發揮重要作用,但這仍需進一步的實驗證實。

綜上所述,Hcy可以誘導巨噬細胞攝取大量膽固醇轉化為泡沫細胞,在這一過程中內質網應激被激活并參與其中。這可能是Hcy導致血管損傷的重要機制之一。