松果菊苷對膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護作用及其機制

李 露,徐臣年,杜 燕,王青艷,李莎莎,安艷新

(1 西安醫學院第一附屬醫院腎內科,西安 710077;2 空軍軍醫大學西京醫院心血管外科;3 西安醫學院第一附屬醫院普外科;*通訊作者,E-mail:liluxayxy@163.com)

膿毒癥是由細菌感染引起的全身性炎癥反應綜合征,已經成為重癥監護室(intensive care unit, ICU)患者死亡的主要原因[1]。在臨床實踐中,越來越多的研究表明,急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是ICU膿毒癥患者常見且嚴重的并發癥,占ICU中急性腎損傷病例的50%以上[2,3]。目前,對膿毒癥急性腎損傷的機制研究取得了顯著進展,其中,腎臟細胞功能障礙和凋亡、腎內血流動力學改變、腎臟炎性浸潤和氧化應激損傷等多種因素共同作用是膿毒癥患者多器官系統衰竭的主要原因[4],但至今對膿毒癥急性腎損傷的治療進展甚少。因此,探索一種新型、有效的膿毒癥性器官衰竭輔助治療藥物具有重要意義。

松果菊苷(echinacoside, ECH)是從管花肉蓯蓉中分離出的苯乙醇苷類化合物,以往研究已證實,松果菊苷具有抗氧化、抗炎癥、抗衰老、抗腫瘤、神經保護及免疫調節等多重藥理作用[5]。近年來研究發現,松果菊苷在糖尿病腎病的治療中也發揮了積極的作用[6-9]。此外,一項體外研究也報道,松果菊苷可以改善膿毒癥大鼠的肝損傷[10]。但松果菊苷能否減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷尚未見相關報道,因此,本研究采用盲腸結扎穿孔術構建膿毒癥小鼠模型,旨在探討松果菊苷對小鼠膿毒癥急性腎損傷的影響,并探討相應的分子機制,為臨床應用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物

清潔級雄性C57BL/6J小鼠40只,6周齡,由西安醫學院動物實驗中心提供。松果菊苷(echinacoside, ECH)購自美國sigma公司。白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA試劑盒購自美國USCN life公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。二氫乙錠(dihydroethidium, DHE)超氧化物陰離子熒光檢測探針購自美國ThermoFisher公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)檢測試劑盒購自美國Roche公司。兔抗小鼠核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)抗體、anti-SIRT3、anti-Ac-SOD2、anti-SOD2、anti-cleaved Caspase 3和anti-β-actin抗體抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及處理 將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組:假手術組(sham組)、松果菊苷組(ECH組)、模型組(CLP組)和造模+松果菊苷處理組(ECH+CLP組),每組10只。

采用經典的盲腸結扎穿孔術構建膿毒癥小鼠模型[11,12]。具體操作步驟如下:術前所有小鼠禁食12 h,經腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后置于無菌操作臺上,腹正中線縱行作一長約1 cm切口,逐層分離并暴露盲腸,于距盲腸末端進行環形結扎,采用18G無菌穿刺針貫穿盲腸1次,并輕擠壓出少量腸內容物,隨后盲腸還納入腹腔,逐層縫合關閉腹腔。sham組和ECH組小鼠僅打開腹腔暴露盲腸,但不進行結扎和穿刺。術后即刻,小鼠背部皮下注射0.5 ml生理鹽水抗休克。ECH組和ECH+CLP組小鼠術后腹腔注射松果菊苷(100 mg/kg)進行治療。sham組和CLP組小鼠術后給予腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 腎臟蘇木精-伊紅(HE)染色 術后24 h,麻醉處死小鼠,取各組小鼠腎組織標本經4%的多聚甲醛固定及石蠟包埋后,制成5 μm厚的腎臟切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察腎組織的病理改變,并行形態學評價,采用半定量量表對腎臟損傷進行評分。

1.2.3 腎功能指標測定 術后24 h,采用眼球摘除法收集小鼠血樣,離心分離取上清液,采用全自動生化分析儀測定小鼠血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血肌酐(serum creatinine, Scr)的水平,剩余血清于-80℃低溫冰箱保存待用。

1.2.4 腎組織炎性因子水平測定 術后24 h,麻醉處死小鼠,取各組小鼠腎組織標本經PBS洗滌干凈后制備成組織勻漿,按照ELISA試劑盒說明書將標準品稀釋并依次加入待測樣品和生物素標記的IL-1β、IL-6、TNF-α抗體,待反應終止后,用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值,通過繪制標準曲線計算小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.5 腎組織NF-κB熒光染色 取前述制備成功的腎組織石蠟切片,經脫蠟復水操作和PBS液洗滌后,滴加100 μl兔抗小鼠NF-κB抗體,4 ℃過夜孵育,DAPI復染細胞核后封片,每張切片隨機取5個高倍視野觀察并拍照,用Image J軟件分析各組NF-κB在腎組織中的熒光表達情況。

1.2.6 腎組織氧化應激水平測定 術后24 h,麻醉處死小鼠,取各組小鼠腎組織標本經PBS洗滌干凈后制備成組織勻漿,按照試劑盒說明書檢測組織勻漿中MDA的含量以及SOD和GSH-Px的活性,以此來評價各組小鼠腎組織的氧化應激情況。

術后24 h,麻醉處死小鼠,取各組小鼠腎組織標本并凍于液氮內,制備厚度為5 μm的腎組織冰凍切片。嚴格按照試劑盒說明書對組織切片進行二氫乙錠染色,每張切片隨機取5個高倍視野觀察并拍照。用Image J軟件分析各組小鼠腎組織ROS的生成量。

1.2.7 腎組織細胞凋亡檢測 取前述制備成功的腎組織石蠟切片,經脫蠟復水操作和PBS液洗滌后,按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書測定腎組織細胞凋亡情況。每張切片隨機取5個高倍視野觀察并拍照,藍色熒光代表所有細胞核,綠色熒光代表凋亡細胞核。細胞凋亡指數以凋亡細胞核數/計數的細胞核總數×100%。

1.2.8 Western blot檢測SIRT3、SOD2、cleaved Caspase 3蛋白表達水平 術后24 h,麻醉處死小鼠,取各組小鼠腎組織標本經細胞裂解液提取總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量。各組組織蛋白(40 μg)依次進行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕轉法轉移至PVDF膜上。經5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h后,PVDF膜在SIRT3(1 ∶1 000)、Ac-SOD2(1 ∶1 000)、SOD2(1 ∶1 000)、cleaved Caspase 3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶3 000)的一抗體管中4 ℃孵育過夜。TBST液洗滌3次,接著加入對應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗管中室溫孵育1 h,滴加ECL發光液并通過Bio-Rad系統成像,以β-actin作為內參,Image Lab軟件分析結果。

1.3 統計學分析

用SPSS 22.0程序對實驗數據進行統計分析,實驗結果以均數±標準差表示,通過單因素方差分析(ANOVA)和LSD-t檢驗對組間進行比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的腎組織結構及腎功能比較

小鼠腎組織HE染色結果顯示,sham組和ECH組小鼠腎組織結構完整,未見炎性細胞浸潤,腎小管上皮細胞無腫脹;CLP組小鼠腎組織可見腎小管腫脹和上皮變性壞死,并伴有大量炎性細胞浸潤,腎間質充血嚴重,腎組織損傷評分明顯升高;給予松果菊苷處理后,ECH+CLP組小鼠腎小管腫脹及上皮細胞壞死明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少,腎間質充血情況顯著好轉,腎組織損傷評分顯著降低(見圖1)。

生化分析檢測小鼠腎功能指標顯示,與sham組相比,CLP組小鼠的BUN和Scr水平均明顯升高(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠的BUN和Scr均顯著降低(P<0.05);而單純給予松果菊苷處理對小鼠的腎功能無明顯影響(P>0.05,見圖1)。

與sham組相比,* P <0.05,* * P <0.01;與CLP組相比,##P <0.01圖1 各組小鼠的腎組織HE染色及腎功能指標比較 (×400)Figure 1 HE staining of renal tissue and renal function in each group (×400)

2.2 各組小鼠腎組織炎癥反應水平比較

ELISA法檢測小鼠腎組織炎癥因子水平顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著增加(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低(P<0.05);而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織炎癥因子水平無明顯影響(P>0.05,見圖2A)。免疫熒光染色檢測小鼠腎組織NF-κB表達情況并觀察其亞細胞定位顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中NF-κB表達量顯著增加(P<0.05),且多表達于腎小球內;給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中NF-κB表達量明顯降低(P<0.05)。而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織NF-κB的表達無明顯影響(P>0.05,見圖2B)。

與sham組相比,* P <0.05,* * P <0.01;與CLP組相比,##P <0.01圖2 各組小鼠腎組織炎癥反應水平比較Figure 2 Comparison of inflammatory response levels in renal tissue between groups

2.3 各組小鼠腎組織氧化應激水平比較

試劑盒檢測小鼠腎組織氧化應激水平顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量顯著減低,膜脂過氧化產物MDA含量顯著增加(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量顯著升高,膜脂過氧化產物MDA含量顯著減少(P<0.05);而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織上述指標無明顯影響(P>0.05,見圖3A)。熒光探針檢測小鼠腎組織ROS生成情況顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中ROS生成量顯著增加(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中ROS的產生明顯被抑制(P<0.05);而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織ROS的生成無明顯影響(P>0.05,見圖3B)。

2.4 各組小鼠腎組織凋亡水平及SIRT3信號表達比較

TUNEL染色檢測小鼠腎組織凋亡情況顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織凋亡細胞明顯增加,且凋亡相關蛋白cleaved Caspase 3表達明顯增加(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織細胞凋亡明顯被抑制(P<0.05)。而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織凋亡情況無明顯影響(P>0.05,見圖4)。

與sham組相比,* P <0.05,* * P <0.01;與CLP組相比,##P <0.01圖3 各組小鼠腎組織氧化應激水平比較Figure 3 Comparison of renal oxidative stress level between groups

與sham組相比,* P <0.05,* * P <0.01;與CLP組相比,##P <0.01圖4 各組小鼠腎組織凋亡水平比較Figure 4 Comparison of apoptosis level in renal tissue between groups

信號通路蛋白檢測顯示,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中SIRT3蛋白表達顯著減低,SOD2乙酰化程度顯著增加(P<0.05);給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中SIRT3蛋白表達顯著升高,SOD2乙酰化程度顯著降低(P<0.05);而單純給予松果菊苷處理對小鼠腎組織SIRT3信號通路的表達無明顯影響(P>0.05,圖5)。

與sham組相比,* P <0.05,* * P <0.01;與CLP組相比,##P <0.01圖5 各組小鼠腎組織SIRT3信號表達比較Figure 5 Comparison of SIRT3 signal expression in renal tissue between groups

3 討論

膿毒癥是一種因免疫系統對感染的反應失調而導致的危及生命的疾病,涉及多器官功能障礙[13]。在膿毒癥患者中,急性腎損傷具有較高的發病率,且膿毒癥誘發的急性腎損傷被視為與患者死亡率增加和慢性腎病進展加劇相關的一個公共衛生問題[14]。因此,尋找膿毒癥急性腎損傷的有效治療策略對于改善膿毒癥患者的預后迫在眉睫。

近年來多項研究顯示,一種來源于松果菊屬植物根莖的苯乙醇苷類化合物松果菊苷,在腎臟相關疾病中發揮了重要的保護作用。姜瑞鳳等[15]報道,松果菊苷對四氯化碳誘導大鼠急性腎損傷起保護作用,相關機制可能與松果菊苷抑制細胞凋亡、抑制炎癥產生和抑制TLR4/NF-κB通路有關。并且松果菊苷可通過抑制TGF-β1的表達,抑制腎間質纖維化和腎組織細胞凋亡,從而保護糖尿病腎病大鼠的腎組織,改善腎功能,延緩糖尿病腎病的發展[6-9]。此外,蘭戴天等[10]發現,松果菊苷可以顯著改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應。然而,松果菊苷能否減輕膿毒癥急性腎損傷還不明確。本研究中,我們發現,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎小管腫脹及上皮細胞壞死明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少,腎間質充血情況顯著好轉,腎組織損傷評分顯著降低;并且ECH+CLP組小鼠的BUN和Scr均顯著降低。以上結果提示,松果菊苷可明顯抑制膿毒癥引起的急性腎損傷。

實驗模型和臨床研究的證據均支持炎癥反應、氧化應激損傷腎組織細胞凋亡在膿毒癥急性腎損傷發生發展過程中的關鍵作用[16,17]。膿毒癥患者組織細胞損傷釋放相關的炎癥介質,通過激活免疫細胞,可進一步導致遠端器官(如腎臟)的炎癥反應,且炎癥因子在膿毒癥后期的多器官功能衰竭中起關鍵作用[18]。同時,NF-κB被認為是炎癥反應的上游調節因子,一旦被激活,可調節多種炎癥因子的生成和釋放,進而惡化組織損傷。此外,大量研究也表明,ROS的生成可誘導腎小管上皮細胞損傷,并且在膿毒癥致急性腎損傷的動物模型中,血清內源性ROS清除物(如超氧化物歧化酶等)的濃度顯著降低,而給予ROS清除劑則可明顯降低模型動物的死亡率并改善其腎功能不全[19]。因而,開發高效的抗炎與抗氧化治療方法或藥物對減輕膿毒癥患者急性腎損傷具有重要的臨床意義。

大量研究報道松果菊苷在抗氧化和抗炎方面具有巨大的潛力。松果菊苷可以通過調節體內氧化與抗氧化反應的平衡來保護機體免受氧化應激損傷,且在多種組織器官的損傷模型中得到了驗證[5,20,21]。值得注意的是,松果菊苷在內毒素誘導的急性肝損傷和腸上皮細胞損傷中均表現出了顯著的抗炎作用[10,22]。在本研究中,我們同樣觀察到,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低,腎組織中NF-κB表達量明顯下降;并且ECH+CLP組小鼠腎組織中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量顯著升高,膜脂過氧化產物MDA含量顯著減少,腎組織中ROS的產生明顯被抑制。同時,ECH+CLP組小鼠腎組織細胞凋亡明顯減低。以上結果提示,松果菊苷可通過抑制氧化應激損傷、炎癥反應和凋亡抵抗膿毒癥引起的急性腎損傷。

Sirtuins蛋白是一類進化上保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴的組蛋白去乙?；?參與細胞脂質代謝、自噬、細胞凋亡、炎性反應、氧化應激、纖維化及線粒體內穩態等多種細胞功能活動[23]。其中,沉默信息調控因子3(silent information regulator 3, SIRT3)是線粒體內最主要的去乙酰化酶,廣泛分布于腎臟近端及遠端腎小管細胞[24]。近些年來,SIRT3已被證實具有重要的腎臟保護作用,在急性腎損傷、糖尿病腎病、高血壓性腎損害及腎臟衰老等多種腎臟疾病中均表現出了積極的保護效應[25]。特別值得注意的是,最新證據顯示,激活SIRT3可明顯緩解膿毒癥導致的急性腎損傷[26],然而SIRT3能否介導松果菊苷減輕膿毒癥急性腎損傷仍有待于進一步探究。本研究結果進一步證實,與sham組相比,CLP組小鼠腎組織中SIRT3蛋白表達顯著減低,SOD2乙酰化程度顯著增加;給予松果菊苷處理后,與CLP組相比,ECH+CLP組小鼠腎組織中SIRT3蛋白表達顯著升高,SOD2乙酰化程度顯著降低。以上結果提示,激活SIRT3信號通路可能是松果菊苷減輕膿毒癥急性腎損傷的潛在分子機制。

綜上所述,松果菊苷可能是通過激活SIRT3信號通路抑制氧化應激損傷和炎癥反應,從而減輕了膿毒癥小鼠急性腎損傷。我們的研究為臨床上應用松果菊苷治療膿毒癥患者腎臟損傷提供了新的理論依據。