白粉病菌侵染條件下小麥酵母雙雜交文庫的構建及可用性檢測

王巧慧，谷建華，郭 歡，呂士凱，吉萬全,張 宏

(1.西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 2.陜西省留壩縣種子管理站，陜西留壩 724100)

小麥作為人類主糧之一，為人類提供五分之一的能量營養供給[1]，是全球貿易總額超過其他所有作物總和的經濟作物[2]。但由禾本科布氏白粉菌小麥專化型(Blumeriagraminisf. sp.tritici)引起的小麥白粉病造成小麥嚴重的產量損失，在中國部分地區白粉病可導致小麥高達40%的減產[3-4]。據估計，截至2050年，小麥產量每年需增加2.4%才能滿足未來人類的糧食需求，而目前糧食增產僅為0.9%[5]。因此，提高小麥抗白粉病能力、降低白粉病的感染面積和發病程度可有效增加小麥產量。

探明白粉菌的侵染機制和小麥抗病的分子機制，是利用分子技術培育抗病品種的基礎。小麥抗病的遺傳基礎分為單基因抗性和多基因抗性[6]，白粉菌小種的不斷變異導致抗病小麥品種抗性喪失，因此，需在抗性基因庫中不斷發現新的抗性基因。隨著基因組測序的快速發展，功能組學研究也成為熱門，研究蛋白質功能的其中一個方法就是找出與其互作的蛋白，構建互作網絡。大多數蛋白都存在蛋白質-蛋白質相互作用，與之相互作用的蛋白質也被認為參與同一細胞內的相同生物過程，從而對探究未知蛋白質的功能提供線索。酵母雙雜交技術是一種可高通量檢測蛋白質-蛋白質相互作用的細胞內檢測技術[7]，該技術可檢測微弱的或是短暫的相互作用，還可以提供對蛋白質穩定和正確折疊所必須的修飾。cDNA的便于克隆和大量表達，使得從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因以及構建蛋白質互作網絡更加便捷。因此，為解析小麥防御機制，構建白粉菌侵染下小麥的cDNA文庫就顯得更加重要。

熱激蛋白在植物體中廣泛存在，依據分子量的不同，可將其分為小分子量熱激蛋白和大分子量熱激蛋白[8-9]。近年來研究發現，熱激蛋白不僅在高溫、低溫、干旱、鹽等非生物脅迫下大量積累，而且還參與抗病蟲害信號傳導過程，在生物脅迫中也發揮重要作用。王付娟等[10]研究發現，熱激蛋白與其他蛋白具有分子伴侶功能，在其他輔助伴侶蛋白作用下促進蛋白質的正確折疊，在逆境脅迫下參與信號轉導過程。HSP40-70是一種廣泛存在于生物體內的大分子量熱激蛋白，有助于蛋白質折疊和分解，防止蛋白質錯誤折疊或聚集[11]。因此，本研究利用酵母雙雜交技術，篩選小麥酵母文庫，得到與抗逆蛋白HSP40-70互作的蛋白，并分析該蛋白功能，以檢測該文庫的可用性和準確性，以期為植物抗逆機制研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為小麥種質N9134，由阿勃非整倍體與野生二粒小麥AS846雜交選育而成，該材料對中國境內目前所有的白粉病菌生理小種都表現為高抗至免疫。將其種植于18 ℃光照16 h/黑暗8 h的人工培養箱中，待長至三葉期時，接種白粉病菌小種BgtE09，48 h后進行取樣。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

接種白粉病菌48 h后，剪取小麥葉片，設置三個生物學重復。使用Takara MiniBEST Plant RNA Extraction kit(TaKaRa，Code No. 9769)試劑盒提取總RNA。用NanoDrop檢測總RNA的濃度和純度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。然后對樣品的總RNA進行純化，供后續構建cDNA文庫。

1.2.2 cDNA第一鏈和第二鏈的合成

取1.0 μg RNA，用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech，Code No.634901)試劑盒合成第一鏈cDNA。用LD-PCR(long distance PCR)法根據Advantage 2 PCR Kit試劑盒說明書來擴增合成第二鏈cDNA。

1.2.3 cDNA文庫均一化處理及擴增

使用TRIMMER DIRECT cDNA Normalization Kit(Evrogen，Cat # NK003)試劑盒對純化后的cDNA進行均一化處理，由于在加入已知配體修飾的ds-cDNA變性后，復性過程中拷貝數高的轉錄產物變為ds-cDNA的速率遠高于低拷貝數的轉錄產物，因此，利用雙鏈特異核酸酶(DSN)降解ds-cDNA片段可達到均一化的目的[12]。對均一化處理后的ss-DNA進行PCR擴增，具體操作見Advantage 2 PCR Kit(Clontech，Code No.639206 )試劑盒說明書。

1.2.4 ds-cDNA純化及短片段去除

使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa，Code No.9761)對擴增得到的cDNA進行純化處理，并用無菌水溶解。使用限制性內切酶SfiI對cDNA進行酶切，并使用CHROMASPIN-1000-TE對酶切后的cDNA過柱處理，去除短片段，經PCI/CI凈化和乙醇精制后，用ddH2O溶解。取1 μL cDNA用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 cDNA初級文庫的構建及庫容檢測

使用DNA ligation Kit(TaKaRa，Code No.6022)試劑盒將pGADT7-SfiI三框載體與5～10 μL過柱后的cDNA于12 ℃過夜連接，純化后得到初級cDNA文庫。取三種少量初級文庫連接產物，分別電轉化感受態細胞HST08，取適量轉化產物分不同濃度梯度涂布于Amp+抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養，通過觀察平板上生長的菌落個數，計算初級文庫庫容。

1.2.6 cDNA文庫插入片段的電泳分析及次級文庫構建

分別取三種讀碼框文庫滴定后的平板，分別隨機挑取16個單菌落，使用pGADT7載體的通用引物(pGADT7-F：5′- GGAGTACCCATACGACGTACC -3′，pGADT7-R：5′- TATCTACGATTCATCTGCAGC -3′)對文庫插入片段進行分析，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行片段大小檢測。隨機選取96個單克隆測序來驗證均一化的效果。然后根據庫容檢測數據，取三種讀碼框文庫共1×106克隆，根據電轉化大腸桿菌感受態細胞說明書，計算需要的連接產物體積，電轉化至感受態細胞HST08中，涂布10個LB平板， 37 ℃過夜培養，并挑單菌落進行搖培，使用NucleoBond Xtra Midi EF(MNG，Code No.U0420B)試劑盒提取質粒，取100 ng質粒用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 HSP40誘餌載體的構建及自激活檢測

使用BamHI限制性內切酶單酶切誘餌載體pGBKT7使其線性化，用諾唯贊同源重組試劑盒將熱激蛋白HSP40-70基因和線性化載體連接。采用PEG/LiAc法轉化重組誘餌載體pGBKT7-HSP40至Y2HGold酵母感受態中，涂布在SD/-Trp固體培養基上，29 ℃培養3～5 d。挑取單克隆并稀釋10、100、1 000倍后分別點于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade固體培養基上，29 ℃培養3～5 d。如果SD/-Trp/X-α-Gal培養基中菌落顏色未變藍，且SD/-Trp/AbA和SD/-Trp/-His/-Ade培養基無菌落生長，可判斷該熱激蛋白不能自激活，可作為誘餌篩選酵母文庫。

1.2.8 以HSP40-70為誘餌篩選酵母文庫及互作蛋白的回轉驗證

挑取SD/-Trp固體培養基上含pGBKT7-HSP40-70的酵母菌落至100 mL的SD/-Trp液體培養基，29 ℃搖培至OD600=0.8左右，室溫離心棄上清，收菌至4 mL的SD/-Trp液體培養基中懸浮。與1 mL雙雜交文庫菌液混合轉入含45 mL 2×YPDA液體培養基的1 L錐形瓶中，緩慢震蕩培養。融合20 h后，用光學顯微鏡觀察酵母有無結合體出現。若出現，用50 mL 0.5×YPDA沖洗錐形瓶2次，離心棄上清，收集菌體至5 mL 0.5×YPDA，涂板于SD/-His /-Ade/X-α-Gal/AbA培養基上，29 ℃培養3～5 d。挑取長出的單菌落劃線至SD/-Trp /-Leu/ -His/-Ade固體培養基上，進行二次篩選，生長良好并顯藍的單菌落即為候選互作蛋白[13]。將候選互作蛋白轉至QDO液體培養基擴繁菌體，使用天根酵母提取質粒盒提取酵母質粒。將所提質粒轉化至DH5α大腸桿菌感受態中，使用pGADT7載體的通用引物進行菌落PCR檢測，挑取陽性克隆送往楊凌奧科生物公司測序。測序結果經NCBI比對，若讀碼框正常，則進行下一步實驗。將質粒分別與pGBKT7-HSP40-70載體回轉至酵母菌Y2HGold中，并涂布于SD /-His/-Ade培養基上。挑取單菌落，稀釋10、100、1 000倍后點在QDO/X/A培養基上，若酵母菌正常生長并顯藍色，則為真實互作蛋白。陽性對照為共轉pGBKT7-53和pGADT7-T兩種質粒的酵母菌，陰性對照為共轉pGBKT7-Lam和pGADT7-T兩種質粒的酵母菌[14]。

1.2.9 序列分析

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST數據庫分析與HSP40-70誘餌蛋白的互作蛋白[15]。

2 結果與分析

2.1 N9134的苗期抗白粉病抗性表現

室內條件下，與小麥苗期接種BgtE09，結果(圖1)表明，對照陜優225的反應型為4級，表現為高感；N9134的反應型為0級，表現為免疫。

A：陜優225(對照)；B：N9134。

2.2 總RNA的提取

提取N9134的總RNA，經分光光度計檢測，其OD260/280比值為2.01，OD260/230比值為2.20，表明RNA純度較高。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能觀察到總RNA中28S和18S兩條帶，表明RNA完整(圖2)，可用于下一步文庫構建。

圖2 N9134葉片總RNA的電泳檢測結果Fig.2 Electrophoresis analysis of total RNA extracted from the leaves of N9134

2.3 ds-cDNA合成與鑒定結果

對合成的cDNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果(圖3A)發現，ds-cDNA片段主要分布在300～3 000 bp之間，且在大約1 500 bp處條帶最亮，表明不同大小片段的mRNA均進行反轉錄，且在1 500 bp處的mRNA轉錄產物量較高。

2.4 ds-cDNA的均一化處理結果

從圖3B可以看出，經過均一化處理的ds-cDNA已經沒有較亮的特異條帶，在2 500 bp以下呈現出亮度均勻的彌散條帶，表明不同片段的轉錄產物拷貝數已被調節至相似數量。

2.5 ds-cDNA SfiI酶切處理及短片段去除結果

從圖3C可以看出，SfiI酶切處理及短片段去除處理后，基本去除了500 bp以下的短片段，保留的長片段增加了包含完整ORF的可能，保證了插入片段信息的質量，使得文庫構建更加 高效。

2.6 初級cDNA文庫構建及庫容檢測結果

將pGADT7-SfiI三框載體與處理后的 cDNA過夜連接后，得到初級cDNA文庫，然后電轉化至感受態細胞并涂板，通過觀察不同稀釋濃度梯度平板上的菌落個數，計算出初級文庫庫容為：讀碼框1文庫約大于1.0×106cfu·mL-1，讀碼框2文庫約大于1.1×106cfu·mL-1，讀碼框3文庫約大于1.2×106cfu·mL-1，庫容量滿足篩庫要求。

2.7 初級cDNA文庫插入外源片段檢測及次級文庫構建結果

通過pGADT7載體檢測引物擴增隨機選取的三種讀碼框菌落，結果(圖4)發現，插入片段的大小分布范圍為400～2 000 bp，平均大于1 000 bp；重組率約為100%。對初級文庫的96個單克隆進行測序，發現有3個冗余序列，冗余率約3%。根據庫容檢測數據，取1×106個克隆的連接產物，電轉化后涂板，并回收菌落提取質粒，取100 ng擴增文庫質粒進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，發現條帶大小一致，說明提取質粒質量較好，核酸濃度檢測儀顯示其濃度大小為1 μg·μL-1，證明文庫擴增質量較好。

2.8 HSP40-70誘餌載體及自激活檢測結果

將構建的誘餌載體pGBKT7-HSP40-70轉化到酵母菌菌株Y2HGold中，將轉化后的單菌落稀釋10、100、1 000倍后點于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培養基上，發現在SD/-Trp培養基上酵母菌生長良好，加入X-α-Gal后無顯色反應，且在SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培養基上均無酵母菌生長(圖5)，說明熱激蛋白HSP40-70誘餌載體不能自激活報告基因，可以進一步通過酵母雙雜交方法篩選構建成功的cDNA文庫。

2.9 誘餌載體篩選文庫及互作蛋白梯度稀釋驗證結果

將轉有pGBKT7-HSP40-70的Y2HGold菌株與小麥雙雜交酵母文庫雜交，當出現結合體時，將其涂布在DDO/X/AbA培養基上，得到5個生長正常且顯藍色的單菌落。將這5個單菌落溶于ddH2O中，并在QDO平板上劃線培養，發現初篩編號為3的酵母菌沒有生長，其余4個編號的酵母菌均長勢良好(圖6)，說明這4個編號的酵母菌含有熱激蛋白HSP40-70的候選互作蛋白。在QDO液體培養基中擴繁長勢良好的候選酵母菌，并提取酵母質粒，轉化至大腸桿菌并進行菌落PCR檢測后，將陽性菌落搖培后送公司測序。利用NCBI分析互作蛋白的測序結果后，本研究選取編號為2和4的2個候選酵母菌進行濃度梯度稀釋驗證。將pGADT7 重組載體分別與pGBKT7-HSP40-70載體共同轉化至酵母Y2HGold菌株中，將其涂布在SD /-His/-Ade培養基上。挑取長出的單菌落稀釋10、100、1 000倍后點至QDO/X/A培養基上，發現酵母菌正常生長并顯藍色(圖7)，說明這2個候選蛋白與誘餌蛋白>HSP40-70存在互作關系，該小麥酵母文庫后續可應用于蛋白互作篩選。

M：250 bp DNA Ladder Marker；1：ds-cDNA；2：均一化ds-cDNA；3：SfiI酶解的ds-cDNA。

M：250 bp DNA ladder marker；1～48：插入外源片段電泳檢測。

圖5 HSP40-70誘餌載體的自激活檢測Fig.5 Self-activation detection of HSP40-70 decoy carrier

圖6 HSP40-70互作蛋白的篩選Fig.6 Screening for interacted protein of HSP40-70

圖7 HSP40-70與候選蛋白的互作驗證Fig.7 Interaction verification between HSP40-70 and candidate proteins

2.10 互作蛋白的功能注釋

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST對2個候選蛋白的ORF序列進行比對分析，結果(表1)發現，編號為2的蛋白為DnaJ類蛋白，編號為4的蛋白編碼E3泛素蛋白連接酶AIP2。

3 討 論

制備高質量的酵母雙雜交cDNA文庫是進行大規模篩選候選互作蛋白的基礎[16]。cDNA文庫的構建具有器官、組織或細胞特異性，由于白粉病的發病部位為葉片，因此，本試驗材料選用白粉病侵染后的葉片，確保了葉片部位特異表達基因的最大化收集。高質量的RNA是構建高質量cDNA文庫的前提，本研究中所提取的RNA電泳檢測顯示有清晰的28S及18S兩條帶，說明所提的RNA質量高。cDNA文庫質量評價有兩個重要的指標，即文庫的庫容和重組序列的完整性。本研究中三框文庫的庫容均大于有效文庫的濃度要求1.0×106cfu·mL-1，且構建的文庫重組率為100%，插入片段分布在400～2 000 bp，大小不同且大片段居多，說明本研究構建的文庫完全滿足高質量文庫的要求。本研究使用熱激蛋白HSP40-70誘餌蛋白對該小麥酵母文庫進行篩選，最終篩選到DnaJ類似蛋白和E3泛素蛋白連接酶AIP2與其互作。DnaJ蛋白屬于熱激蛋白的分子伴侶，參與大部分細胞過程[17]。泛素蛋白酶體途徑是所有真核生物體生長發育以及應對脅迫的重要途徑，泛素連接酶E3特異性識別靶蛋白，在該途徑中具有重要的作用[18-19]。本研究中HSP40-70和E3泛素蛋白連接酶AIP2互作，說明HSP40-70參與植物脅迫應答過程。綜上所述，本研究構建的小麥酵母文庫可應用于后續的蛋白互作篩選。

本研究采用的SMART酵母文庫構建體系使得試驗步驟更加簡潔。Zhang等[20]研究發現，同時依賴DSN酶降解ds-cDNA和DNA-RNA雜交鏈的特性來均一化轉錄產物，使較短的基因片段也能保留下來。本研究構建的三框cDNA文庫是在單一cDNA文庫的基礎上，增加堿基使其讀碼框后移一位或兩位，從而使cDNA出現三種讀碼方式，保證捕捉到生物體內真實的讀碼方式[20]。在白粉菌侵染小麥的過程中，會觸發一系列免疫以及抗病反應，我們既可利用已知的候選蛋白和cDNA文庫去篩選相關的互作蛋白，構建互作網絡，也可以利用白粉菌某些毒性蛋白來快速獲取小麥體內的病原菌應答蛋白，從而為探明病菌侵染與植物防御的分子機制奠定基礎。

表1 互作蛋白的NCBI BLAST結果Table 1 NCBI BLAST results of the interacting proteins