HPLC多指標成分定量與化學計量學相結(jié)合的搜風理肺丸質(zhì)量評價

馮婉紅，馬靈珍（.浙江中醫(yī)藥大學濱江學院附屬江南醫(yī)院藥學部，浙江 杭州 30；.亳州職業(yè)技術(shù)學院藥學院，安徽 亳州 36800）

搜風理肺丸是由桔梗、荊芥穗、黃芩等14味中藥材組方而成，臨床上主要用于外感風寒、肺失宣降所致發(fā)熱惡寒、頭痛無汗、四肢酸軟、鼻塞流涕、咳嗽痰多、胸悶喘息等病癥的治療[1]。中藥復方制劑具有多組分、多靶點、多通道等特點，所含成分相互協(xié)同制約，對機體生物分子網(wǎng)絡(luò)進行廣泛調(diào)節(jié)，以達到臨床治療效果。搜風理肺丸現(xiàn)行質(zhì)量控制標準[1]和文獻報道[2]僅對當中黃芩苷進行定量分析，未建立多指標成分質(zhì)量控制方法，難以全面反映該制劑的整體產(chǎn)品質(zhì)量，直接影響臨床療效的穩(wěn)定性和一致性。多成分質(zhì)量控制模式能全面反映中成藥復方制劑的整體內(nèi)在質(zhì)量，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門不斷提升該制劑的質(zhì)量控制標準，完善藥材來源和制劑生產(chǎn)過程控制，以達到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。本文以君臣佐使中醫(yī)配伍理論為依據(jù)，參考中藥質(zhì)量標志物的確認原則，采用HPLC法同時測定搜風理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的含量，并采用聚類分析、主成分分析等化學計量學方法對測定結(jié)果進行分析評價，為該制劑質(zhì)量控制標準的提升提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

對照品黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素來源于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110715-201821、112002-201702、111711-201904和111904-201804，質(zhì)量分數(shù)分別為95.4%、98.5%、99.4%和98.9%。對照品去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3來源于成都普思生物科技股份有限公司，批號分別為PS010234和PS010235，質(zhì)量分數(shù)分別為98.8%和98.9%。對照品桔梗皂苷E和白花前胡E素來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號分別為18030721和18031222，質(zhì)量分數(shù)分別為98.5%和99.9%。搜風理肺丸（規(guī)格：9 g）分別來源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠（批號分別為20013006、20013008、20013012、20013015、20013018、20013019和20013021，編號依次為S1～ S7）和桂林三金藥業(yè)股份有限公司（批號分別為191007、191109和200302，編號依次為S8 ～ S10）。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BS110S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-3200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別取去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素對照品適量，精密稱定，用60%甲醇制成濃度分別為0.128、0.194、0.106、3.854、0.698、0.622、0.156和0.272 mg·mL-1的混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液1.0 mL，用60%甲醇稀釋至20 mL，制成去芹糖桔梗皂苷E 6.4 μg·mL-1、桔梗皂苷E 9.7 μg·mL-1、桔梗皂苷D35.3 μg·mL-1、黃芩苷192.7 μg·mL-1、漢黃芩苷34.9 μg·mL-1、白花前胡甲素31.1 μg·mL-1、白花前胡乙素7.8 μg·mL-1、白花前胡E素13.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取適量搜風理肺丸，剪碎后取2.0 g，精密稱定，加入60%甲醇20 mL，對樣品進行30 min的超聲處理，放冷后用60%甲醇稀釋至25 mL，混合均勻，過濾，制得搜風理肺丸供試品溶液。取適量按搜風理肺丸質(zhì)量標準項下處方比例和制法制得的缺桔梗、缺黃芩和缺前胡的陰性供試品，按上述方法制成陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件與專屬性實驗

以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長分別為210 nm（0 ～ 23 min檢測去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3）[3-4]、280 nm（24 ～ 34 min檢測黃芩苷和漢黃芩苷）[5-7]和321 nm（35 ～ 60 min檢測白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素）[8-9]。理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計應≥ 4000。精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液及“2.1.2”項下供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄所檢測色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，混合對照品和搜風理肺丸供試品色譜圖中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素與相鄰色譜峰均能良好分離（分離度均＞1.5）；色譜峰峰形對稱，拖尾因子符合規(guī)定要求；陰性供試品對搜風理肺丸中上述成分的同時測定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖A - 混合對照品，B - 搜風理肺丸供試品，C - 桔梗陰性供試品，D -黃芩陰性供試品，E - 前胡陰性供試品；1 - 去芹糖桔梗皂苷E，2 -桔梗皂苷E，3 - 桔梗皂苷D3，4 - 黃芩苷，5 - 漢黃芩苷，6 - 白花前胡甲素，7 - 白花前胡乙素，8 - 白花前胡E素Fig 1 HPLC chromatogramA - mixed reference, B - Soufeng Lifei pills sample, C - negative sample without platycodonis radix, D - negative sample without scutellaria radix, E - negative sample without peucedanum radix; 1 -deapi-platycoside E, 2 - platycoside E, 3 - platycodin D3, 4 - baicalin,5 - wogonoside, 6 - praeruptorin A, 7 - praeruptorin B, 8 - praeruptorin E

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.1.1”項下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分別用60%甲醇稀釋至20 mL，制得系列質(zhì)量濃度溶液，各取10 μL進樣，測定去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面積，以峰面積為Y軸，質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為X軸進行回歸，得回歸方程和線性范圍，見表1。

表1 搜風理肺丸中8種成分的回歸方程、r和線性范圍Tab 1 Regressive equations、correlation coefficients and linear ranges of eight components in Soufeng Lifei pills

2.3.2 精密度 取同一份搜風理肺丸（編號：S1）供試品溶液進樣10 μL，測定8種成分的峰面積，測得各成分峰面積的RSD分別為1.20%、1.07%、1.42%、0.55%、0.71%、0.68%、0.81%、1.05%。

2.3.3 重復性 取同一批次搜風理肺丸（編號：S1），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，重復操作6次，各取10 μL進樣測定8種成分的峰面積，計算得各成分含量的RSD分別為1.76%、1.69%、1.87%、0.96%、1.25%、1.32%、1.61%、1.79%。

2.3.4 穩(wěn)定性 取一份搜風理肺丸（編號：S1）供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h各進樣10 μL，檢測8種成分的峰面積，結(jié)果顯示搜風理肺丸供試品溶液24 h穩(wěn)定，各成分峰面積的RSD分別為1.13%、1.22%、1.39%、0.60%、0.88%、0.75%、0.89%、1.12%。

2.3.5 加樣回收率 取已知去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量的搜風理肺丸（編號：S1）9份，每份1.0 g，精密稱定，隨機平分成3組，精密加入混合對照品溶液（去芹糖桔梗皂苷E 0.086 mg·mL-1、桔梗皂苷E 0.138 mg·mL-1、桔梗皂苷D30.054 mg·mL-1、黃芩苷2.852 mg·mL-1、漢黃芩苷0.496 mg·mL-1、白花前胡甲素0.432 mg·mL-1、白花前胡乙素0.118 mg·mL-1、白花前胡E素0.174 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL各一組，再按“2.1.2”項下方法制成加樣供試品溶液。精密吸取上述9份溶液各10 μL，進樣檢測8種成分的峰面積，計算得8種成分平均加樣回收率分別為98.70%、97.97%、96.95%、100.10%、99.22%、99.78%、97.73%、98.05%，RSD分別為1.41%、1.38%、0.97%、0.89%、1.00%、0.83%、1.26%、1.52%（n= 9）。

2.4 樣品含量測定

取搜風理肺丸樣品10批，每批次按照“2.1.2”項下方法制備搜風理肺丸供試品溶液3份，各進樣10 μL檢測去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面積，計算得8種目標化合物的含量，見表2。

表2 搜風理肺丸中8種成分的含量測定結(jié)果. mg·g-1，n = 3Tab 2 The content results of eight components in Soufeng Lifei pills. mg·g-1, n = 3

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 將“2.4”項下10個批次搜風理肺丸中8種成分含量測定結(jié)果導入SPSS 26.0軟件中，采用組間聯(lián)接聚類方法，以歐氏距離為測度，對10個批次搜風理肺丸樣品進行聚類分析。結(jié)果顯示，當類間距離為15時，10批搜風理肺丸樣品聚為2類，樣品S4、S6、S5、S1、S7、S2和S3聚為第Ⅰ類，樣品S8、S10和S9聚為第Ⅱ類。從分類結(jié)果來看，同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的搜風理肺丸樣品歸為一類，表明同一生產(chǎn)企業(yè)所生產(chǎn)樣品產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，不同企業(yè)間樣品存在一定的質(zhì)量差異，可能與搜風理肺丸所用原藥材源頭控制和制劑生產(chǎn)過程參數(shù)控制等因素差異有關(guān)。

2.5.2 主成分分析 將“2.4”項下10個批次搜風理肺丸中8種成分含量測定結(jié)果導入SPSS 26.0軟件中，對10批搜風理肺丸樣品進行主成分分析，以累積方差貢獻率＞ 85%、初始特征值＞ 1為提取標準，主成分分析結(jié)果顯示前4個主成分特征值分別為2.476、2.110、1.616和1.135，均＞ 1，曲線陡峭，后4個主成分特征值均＜ 1，曲線較為平緩，前4個主成分方差貢獻率分別為30.949%、26.373%、20.206%和14.189%，累積方差貢獻率達到91.717%，表明提取前4個主成分較為合理，能夠代表搜風理肺丸中的大部分信息。成分矩陣結(jié)果顯示白花前胡E素、去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3對主成分1貢獻較大，桔梗皂苷E和黃芩苷對主成分2貢獻較大，漢黃芩苷和白花前胡乙素對主成分3貢獻較大，白花前胡甲素對主成分4貢獻較大。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化選擇

在搜風理肺丸定量測定中，本實驗參考去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素被檢測所用流動相的相關(guān)文獻，對比考察了甲醇-水[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液[2]、乙腈-水[3-4,10]、乙腈-0.1%磷酸溶液[5]、乙腈-0.1%三氟乙酸溶液[6]、乙腈-0.1%甲酸溶液[7]等流動相體系對色譜峰分離效果的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，所測8種目標化合物色譜峰的峰形較好，基線較為平穩(wěn)。通過對流動相比例的不斷摸索優(yōu)化，最終確定流動相程序?qū)λ扬L理肺丸8種成分含量進行同時檢測。

3.2 目標化合物的選擇

搜風理肺丸由荊芥穗、紫蘇梗、薄荷、前胡、陳皮、去皮炒苦杏仁、桔梗、去瓤麩炒枳殼、旋復花、竹茹、法半夏、蜜炙瓜萎子、黃芩和甘草14味中藥材組方而來，所含成分共同作用，以達清熱解表、宣肺止咳之功。中成藥復方制劑所含成分復雜，其藥理作用和臨床治療效果是所有藥材共同作用的結(jié)果，多指標成分質(zhì)量評價模式能夠較為全面地評價其產(chǎn)品質(zhì)量，本文依據(jù)君藥所含成分為首選，同時做到兼顧臣佐使藥所含成分，選取方中君藥桔梗所含特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，臣藥黃芩所含藥效成分黃芩苷和漢黃芩苷，以及佐藥前胡所含代表性成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素為定量控制指標成分，以期為全面評價搜風理肺丸整體質(zhì)量提供實驗數(shù)據(jù)支持。

本實驗采用HPLC法對搜風理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量進行了定量控制，首次建立了該制劑多指標成分質(zhì)量控制模式，同時對所測8種成分的含量結(jié)果采用化學計量學方法進行了聚類分析和主成分分析。所建立的方法符合定量分析要求，操作簡單、結(jié)果準確，從含量檢測結(jié)果來看，搜風理肺丸中所測成分含量存在一定的批間差異，表明建立多成分質(zhì)量評價模式有利于確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性；從化學計量學統(tǒng)計分析結(jié)果來看，同一生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品較為穩(wěn)定，不同企業(yè)間產(chǎn)品差異較大，可能與各生產(chǎn)企業(yè)對制劑生產(chǎn)所用原藥材的種屬來源、產(chǎn)地、種植方式、采收季節(jié)、加工方法等因素差異以及制劑生產(chǎn)過程控制有關(guān)，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門及時關(guān)注產(chǎn)品質(zhì)量源頭控制和生產(chǎn)過程控制，逐步完善制劑質(zhì)量標準和原藥材內(nèi)控質(zhì)量標準的建立，以確保搜風理肺丸產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性，更好地為臨床合理用藥提供保障。