人臍帶間充質干細胞對高濃度葡萄糖誘導的人視網膜色素上皮細胞自噬水平的影響及其機制

閆 瑾,李 蓉,王 莉,張桂鷗,楊 揚,劉文蘭,朱 丹

(1 西安醫學院醫學技術學院眼視光教研室,西安 710021;2 西安醫學院第一附屬醫院眼科;3 空軍軍醫大學西京醫院眼科,全軍眼科研究所;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

1 材料與方法

1.1 材料

經產婦本人及家屬簽署臍帶用于實驗研究的知情同意書后,取2018-2019年出生的健康足月嬰兒臍帶。人ARPE-19株(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司);兔多抗自噬標志性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-related protein 1 light chain 3,LC3)B(Ab48394)、兔單抗CD90(ab133350)(英國abcam公司);兔多抗Beclin-1(3495S)、兔多抗p-mTOR(5536)(美國CST公司);兔多抗P62(AF5384,美國Affinity Biosciences公司);兔多抗mTOR(20657-1-AP,武漢三鷹生物技術有限公司);兔多抗GAPDH(AB-P-R 001,杭州賢至生物有限公司);HRP標記羊抗兔二抗(BA1054,武漢博士德生物工程有限公司);噻唑蘭MTT(3580MG250,德國BIOFROX公司);人VEGF ELISA試劑盒(Human VEGF-A ELISA Kit E-EL-H0111c武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);FACS-Calibur流式細胞儀(美國Becton Dikinson公司);倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司,型號ECLIPSE Ts2);微型高速離心機(美國Labnet公司,型號C2500-R-230V);全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司,型號mμlISKANMK3);透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司,型號HT7700-SS)。

1.2 方法

1.2.1 hUCMSCs的分離、培養和鑒定 組織塊貼壁法分離培養hUCMSCs[14]。組織塊附著后添加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基,每隔3 d換液,待細胞融合達80%-90%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,比例為1 ∶3。hUCMSCs細胞傳代至第3代,參照文獻[15]的方法,胰酶消化,PBS重懸,按照使用說明書加入小鼠抗人CD90單克隆抗體,避光孵育后流式細胞儀檢測。

1.2.2 細胞培養及分組 選用DMEM/F12(含10% FBS+1%青霉素和鏈霉素)培養液,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養ARPE-19細胞,實驗選用處于對數生長期的第5-10代細胞,按照5.0×105個/孔傳代于6孔板內,隨機分為對照組(PBS)、高糖組(25 mmol/L D-glucose)和高糖+hUMSCs組。高糖+hUMSCs組使用Transwell實現hUMSCs與ARPE-19細胞的非接觸共培養,在ARPE-19細胞培養基中加入25 mmol/L D-glucose接種于上室,hUMSCs接種于下室,三組培養時間均為48 h。

1.2.3 MTT法檢測ARPE-19細胞增殖率 使用微量酶比色法測定試劑盒,根據說明書檢測ARPE-19細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(對照組平均OD值-空白孔平均OD值)×100%。

1.2.4 透射電子顯微鏡下觀察自噬體的形成 刮取各組細胞,戊二醛固定2 h,充分漂洗后,在質量分數為1%鋨酸中4 ℃固定,脫水,包埋。在裸銅網格上制備超薄切片,鈾鉛雙染色,透射電子顯微鏡下觀察自噬體形態、結構及數量,拍照。

1.2.5 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中自噬蛋白LC3B、Beclin-1、P62和信號通路蛋白mTOR、p-mTOR的表達 收集各組細胞裂解充分后,離心提取總蛋白,BCA法蛋白定量。蛋白上樣,SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,封閉,滴加一抗,一抗稀釋濃度如下:LC3B(1 ∶1 000)、Beclin-1(1 ∶1 000)、P62(1 ∶1 000)、mTOR(1 ∶500)、p-mTOR(1 ∶1 000)、GADPH(1 ∶1 000),辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1 ∶50 000)孵育。暗室顯影,依據膠片灰度值,與內參GAPDH比較計算出LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值及Beclin-1、P62、mTOR、p-mTOR的蛋白相對表達量,每組3次生物學重復,取平均值。

1.2.6 ELISA法檢測ARPE-19細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達 按照使用說明,采用人VEGF酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測ARPE-19細胞上清液中VEGF蛋白濃度。酶標儀測量OD450值。應用直線相關回歸分析,在標準曲線上查出待測樣本對應的VEGF濃度。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 hUCMSCs的形態觀察及鑒定

使用倒置顯微鏡觀察臍帶華通氏膠組織(Wharton jelly)貼壁培養的第3代hUCMSCs細胞呈長梭形或紡錘形,形態均一,緊密排列,類似纖維細胞,集落生長,細胞分布呈魚群狀或漩渦狀(見圖1A)。流式細胞儀檢測結果顯示,hUCMSCs陽性表達標志蛋白CD90(見圖1B)。

對照組使用常規心電圖進行檢查，選擇本院現有的設備對患者實施監測，準確記錄各項檢查指標與結果。研究組使用多普勒超聲聯合心電圖檢查，將探頭的頻率設定在2.0～4.0MHz之間，由經驗豐富的醫生進行操作，指導患者調整呼吸，采用左側臥位姿勢，將心臟探頭放置于患者的左側胸骨旁，詳細觀察患者的胸骨旁左室、二腔心、心臟各個節段室壁運動狀態、厚度以及彩色多普勒血流狀態等[1]，同時對患者的心率以及心室血流等指標進行記錄。多普勒超聲心動圖診斷標準為：患者發生節段性的室壁運動異常，心肌梗死區域節段的心室壁運動明顯減弱或者消失；梗死區域節段的室壁厚度下降，有明顯的心肌異常回聲，呈現增強或者減弱，心內膜的回聲斷裂。

圖1 hUCMSCs的形態觀察及鑒定Figure 1 Morphology and identification of hUCMSCs

2.2 細胞中自噬體超微結構的觀察

透射電子顯微鏡下可見典型的自噬體為包裹了蛋白質及細胞器等吞噬物的小囊泡,具備雙層膜結構。電鏡檢查顯著反映了高糖環境及hUMSCs對ARPE-19細胞自噬活性的影響,對照組細胞中僅見少量自噬體,高糖組及高糖+hUMSCs組細胞中自噬體數量明顯增多,而高糖+hUMSCs組細胞中自噬體數量較高糖組減少(見圖2)。

圖2 hUMSCs對高糖條件下ARPE-19細胞內自噬體形成的影響 (×8 000,bar=1.0 μm)Figure 2 Effect of hUMSCs on the autophagosomes formed in ARPE-19 cells under the condition of high glucose (×8 000,bar=1.0 μm)

2.3 hUMSCs對高糖條件下ARPE-19細胞增殖的影響

MTT法檢測結果顯示,各組ARPE-19細胞增殖率總體比較差異有統計學意義(F=73.952,P=0.000)。與對照組相比,高糖組和高糖+hUMSCs組細胞增殖率降低(均P=0.000),但高糖+hUMSCs組細胞增殖率高于高糖組(P=0.007,見圖3)。

與對照組比較,* P <0.05;與高糖組比較,#P <0.05圖3 hUMSCs能夠提高高糖條件下的ARPE-19細胞增殖率Figure 3 HUMSCs increases the proliferation rate of ARPE-19 cells under the condition of high glucose

2.4 hUMSCs對ARPE-19細胞在高糖條件下LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1、P62蛋白相對表達量的影響

蛋白免疫印跡法檢測結果顯示,與對照組相比,高糖組ARPE-19細胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1蛋白條帶明顯增強,P62蛋白表達降低,自噬活性明顯升高。相較于高糖組,ARPE-19細胞與hUMSCs共培養后,LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin-1的蛋白表達減弱,P62的表達明顯增強(見圖4)。

三組間ARPE-19細胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值、Beclin-1和P62蛋白的相對表達總體比較差異均有統計學意義(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ:F=33.511,P=0.001;Beclin-1:F=86.791,P=0.000;P62:F=69.984,P=0.000)。高糖組和高糖+hUMSCs組細胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1蛋白的相對表達相較于對照組顯著增加(均P<0.05);高糖+hUMSCs組細胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1蛋白的相對表達相較于高糖組顯著減少,差異均有統計學意義(均P<0.01)。高糖組和高糖+hUMSCs組細胞中P62的相對蛋白表達相較于對照組顯著降低(均P<0.05),高糖+hUMSCs組P62蛋白的相對表達相較于高糖組顯著增加,差異有統計學意義(P=0.001,見圖5)。

圖4 各組細胞中LC3B、Beclin-1和P62的表達情況Figure 4 Expression of LC3B,Beclin-1 and P62 in the three groups

2.5 hUMSCs對ARPE-19細胞在高糖條件下mTOR和p-mTOR蛋白表達量的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示,高糖組p-mTOR蛋白條帶的灰度相較于對照組明顯減弱,高糖+hUMSCs組p-mTOR蛋白的表達較高糖組明顯增強(見圖6)。對照組、高糖組和高糖+hUMSCs組細胞中的mTOR蛋白相對表達分別為0.521±0.022,0.549±0.026和0.523±0.029,組間總體比較差異無統計學意義(均P>0.05);磷酸化蛋白p-mTOR蛋白相對表達為0.150±0.008,0.047±0.009和0.088±0.15,組間總體比較差異均有統計學意義(F=64.895,P=0.000)。高糖組和高糖+hUMSCs組中p-mTOR相對表達低于對照組,差異均有統計學意義(均P<0.05),高糖+hUMSCs組的p-mTOR表達高于高糖組,差異有統計學意義(P<0.05,見圖6)。

與對照組比較,* P <0.05;與高糖組比較,#P <0.01圖5 hUMSCs對高糖條件下ARPE-19細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62相對蛋白表達的影響Figure 5 Effect of hUMSCs on the expression of LC3B,Beclin-1 and P62 in ARPE-19 cells under the condition of high glucose

與對照組比較,* P <0.05;與高糖組比較,#P <0.05圖6 hUMSCs對高糖條件下ARPE-19細胞mTOR和p-mTOR蛋白表達的影響Figure 6 Effect of hUMSCs on the expression of mTOR and p-mTOR in ARPE-19 cells under the condition of high glucose

2.6 hUMSCs對高糖條件下ARPE-19細胞上清液中VEGF含量的影響

酶聯免疫吸附試驗顯示,對照組、高糖組、高糖+hUMSCs組ARPE-19細胞上清液中VEGF的含量分別為(46.67±7.09)ng/L,(154.43±13.51)ng/L和(88.24±15.37)ng/L,整體比較差異有統計學意義(F=56.669,P=0.000)。相較于對照組,高糖+hUMSCs組和高糖組VEGF的濃度明顯升高(均P<0.01),高糖+hUMSCs組細胞VEGF含量低于高糖組(P=0.001,見圖7)。

與對照組比較,* P <0.01;與高糖組比較,#P =0.001圖7 hUMSCs能夠降低ARPE-19細胞中VEGF的表達Figure 7 HUMSCs inhibits the content of VEGF protein in ARPE-19 cells under the condition of high glucose

3 討論

RPE層位于視網膜的最外層,為單層色素細胞,主要功能包括:維持光感受器的新陳代謝、吸收光線、抗氧化、為視網膜外層提供營養、參與視覺循環和分泌細胞因子等,對維持視網膜光感受器微環境有重要作用。長期處于高血糖環境會誘發RPE細胞出現缺血、氧化應激、炎癥激活等病理改變,影響其結構和功能,同時RPE細胞分泌的各種細胞因子在DR發生發展過程中起到重要作用[16]。其中VEGF會使視網膜血管內皮細胞間的緊密連接蛋白表達降低,破壞視網膜內屏障,增加血管通透性,參與血管炎癥反應,還可以促進血管內皮細胞分裂增殖,形成管腔,是促進新生血管形成的關鍵因子[17,18]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓、脂肪和臍帶華通氏膠等多種組織中的,來源于中胚層的一類干細胞,具備多向分化潛能[19],MSCs具有不易引起免疫反應、可體外分離連續傳代培養等優勢[20]。hUMSCs來源于人臍帶中的華通氏膠組織,易于大量獲得。本研究成功提取并體外培養了hUMSCs,流式細胞儀鑒定結果顯示其高表達間質細胞標志CD90,符合MSCs表面標志物鑒定標準[15]。在DR的治療中,hUMSCs具有減輕視網膜水腫,營養和保護視網膜神經的功能,也可以對視網膜血管內皮細胞起免疫調節作用[6-8]。大量的實驗研究發現,MSCs的修復和抗炎作用能夠通過旁分泌這一形式實現[21-25],我們在Transwell中建立hUMSCs和ARPE-19細胞間接共培養體系,結果顯示,高糖環境明顯降低ARPE-19細胞增殖率,調高VEGF的蛋白表達水平,與hUMSCs共培養后細胞的增殖率升高,有效降低VEGF水平,對高糖損傷的RPE細胞有顯著的保護作用。

生理狀態下細胞內的自噬水平維持在一定的較低水平,對細胞的代謝、增殖、生長、分化、修復以及活性的維持都起到重要作用[9,26,27]。在自噬這一動態過程的不同階段中,相關特異性基因編碼的20多種蛋白起相互協同作用。LC3在主導自噬小體的雙膜延伸過程時,通過半胱氨酸蛋白酶活化為胞漿中的LC3-Ⅰ,再與磷脂酰乙醇胺偶聯生成錨定于自噬小體內外膜上的脂質型LC3-Ⅱ,在自噬體被溶酶體降解前能夠較穩定地存在,因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的轉化比例值能較好反映自噬情況[28-30],LC3存在多種不同類型,目前自噬的蛋白標記物常選用LC3B。Beclin-1收集來自高爾基體、內質網等細胞器的細胞內源性雙膜成分,在自噬體形成的過程中負責雙膜結構起始段的合成[31],因此Beclin-1蛋白表達量也是檢測自噬水平的常用標記物。P62是自噬溶酶體膜相關標記蛋白,參與大分子物質降解過程,其表達與自噬水平負相關,在自噬過程中主要介導底物識別,因此當自噬反應激活清除細胞內的蛋白質時會被優先降解,從而導致其表達水平降低[32,33]。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測LC3B的切割情況、Beclin-1的蛋白相對表達量及P62的降解程度,三項結果共同檢測RPE細胞的自噬水平。目前認為檢測自噬情況的金標準是電子顯微鏡觀察到自噬小體的特征性雙層膜結構[28],但在自噬發生的不同動態階段中,會產生與自噬小體形態類似的自噬溶酶體和自噬內涵體,在未做特殊標記的情況下,很難準確區分這些結構。此外在不同切面的切片中觀察到的自噬小體數量差別較大,會導致電鏡檢測結果產生誤差。因此本文采用自噬標志性蛋白檢測和電鏡觀察兩種方式,綜合分析細胞內的自噬水平,確保實驗結果的準確性和嚴謹性。本研究中高糖環境下RPE中自噬體增加,LC3B-Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1蛋白表達增加,而P62表達下降,細胞的自噬被激活,與既往研究結果一致[13],hUMSCs可使自噬體減少,細胞表達LC3B-Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1蛋白下降,P62水平增加。

mTOR是細胞內一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,在細胞的生長合成、代謝增殖、衰老、凋亡及自噬中表現出重要的調節作用[34]。mTOR是自噬調節經典通路PI3K/AKT/mTOR的關鍵信號蛋白[35],同時對溶酶體功能也能起到調節作用[36]。mTOR能調控自噬過程的開始和自噬體形成[37],介導溶酶體合成[38]和自噬性溶酶體再生[39],調節溶酶體細胞內分布[40],因此mTOR參與了自噬的整個動態過程。為了研究hUMSCs減輕高糖誘導的RPE細胞自噬的機制,本研究進一步檢測了三組細胞中mTOR蛋白的磷酸化水平。結果表明,mTOR蛋白在hUMSCs對高糖環境下RPE細胞自噬的影響中扮演重要角色。高糖組p-mTOR水平顯著下降,hUMSCs共培養可上調其表達,從而負向調控RPE細胞自噬,降低自噬水平。

綜上所述,本研究提示hUMSCs對高糖環境下RPE細胞自噬的影響與其對mTOR信號蛋白活性的調節有關,hUMSCs通過激活mTOR抑制高糖條件下ARPE-19細胞的自噬水平,下調VEGF的表達,對RPE細胞起到保護作用。但mTOR蛋白參與了多條調控自噬的信號通路,hUMSCs通過何種通路調節自噬,及其在體內對自噬水平的影響還需后續研究來明確。