基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討顛倒木金散治療冠心病的分子機(jī)制研究

●葉招娣 劉中勇

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（簡(jiǎn)稱“冠心病”）是工業(yè)化國(guó)家最常見(jiàn)的死亡原因，也是發(fā)展中國(guó)家心血管疾病發(fā)病率和死亡率上升的重要原因[1]。2017年的心臟病大會(huì)揭示，冠心病的患病率呈攀升態(tài)勢(shì)，缺血性心臟病的患病率從2003 年的4.6‰提高到2015 年的10.2‰，增加了2倍多[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療冠心病的主要手段包括藥物治療如穩(wěn)定斑塊、降低血脂、改善缺血，還包括有創(chuàng)治療如經(jīng)皮冠脈介入治療和冠脈動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)[3]。冠心病歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，治療以行氣活血為主，顛倒木金散為這一類藥的代表，方中木香、郁金行氣活血化瘀。在現(xiàn)代基礎(chǔ)研究的體系里發(fā)現(xiàn)中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有助于反映中藥復(fù)方背后的分子、通路機(jī)制，將中藥轉(zhuǎn)換成一個(gè)個(gè)活性成分，活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系起來(lái)，指導(dǎo)臨床用藥，故而本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討顛倒木金散治療冠心病的潛在機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 顛倒木金散相關(guān)靶點(diǎn)篩選通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)平臺(tái)下載中藥化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的2個(gè)ADME 屬性值進(jìn)行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)篩選冠心病相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“cardiovascular disease”“coronary heart disease”“coronary artery disease”為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org/）和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）進(jìn)行篩選，合并疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到冠心病的疾病靶點(diǎn)。

1.3 顛倒木金散成分-冠心病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)為尋找顛倒木金散藥物相關(guān)靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)間的相互作用，將得到的藥物有效成分及靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行合并，得到顛倒木金散有效成分治療冠心病的靶點(diǎn)。將得到的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。其中節(jié)點(diǎn)代表木香、郁金有效成分、靶點(diǎn)等，邊代表木香、郁金成分與成分、成分與靶點(diǎn)之間、藥物與成分靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.4 藥物-疾病核心PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥物和疾病的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stringdb.org）中，將物種定義為“人”，構(gòu)建郁金-木香治療冠心病的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)文件導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中，并運(yùn)用其內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等，以Degree大于平均值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心靶點(diǎn)[4]。

1.5 功能富集與生物通路分析將藥物和疾病的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)傳輸至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“genelist”，種屬選為“Homosapiens”，之后選取“geneontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及基因本體（Gene Ontology，GO）生物過(guò)程的富集分析。

2 結(jié)果

2.1 顛倒木金散活性成分的篩選通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索郁金-木香的有效成分，并與文獻(xiàn)中檢索得到的有效成分一同納入，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)最終得到活性成分29個(gè)（包括一個(gè)重復(fù)成分），其中木香13個(gè)，郁金16個(gè)，其中有效成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、結(jié)晶酚、丁香苷、柚皮素等。見(jiàn)表1。

2.2 顛倒木金散治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)將收集到的郁金-木香靶點(diǎn)刪除重復(fù)值后，得到兩味藥有效成分作用靶點(diǎn)78個(gè)，冠心病靶點(diǎn)5332個(gè)，將藥物與疾病的靶點(diǎn)合集得到藥物與疾病的Venn 圖。由圖1可見(jiàn)，藥物與疾病的共有靶點(diǎn)為67 個(gè)，即郁金-木香治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顛倒木金散治療冠心病的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖2。其中，里面的小圓圈代表藥物的活性成分，外面的大圓圈代表藥物的作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的面積、顏色透明度和字體的大小代表其度數(shù)，面積越大、顏色越深和字體越大說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要；線條的粗細(xì)也代表兩者關(guān)系的緊密。圖中共有108 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中木香、郁金各1 個(gè)，藥物治療疾病的活性成分28 個(gè)，藥物的靶點(diǎn)78 個(gè)。通過(guò)CytoScape3.7.1 內(nèi)置的NetworkAnalyzer 分析顛倒木金散治療冠心病的核心成分，按Degree 值進(jìn)行排序，可見(jiàn)β-谷甾醇的介度為0.41197061，緊密度為0.55154639，連接度為50，預(yù)測(cè)β-谷甾醇為顛倒木金散治療冠心病的主要成分。具體見(jiàn)表2。

圖1 藥物疾病韋恩圖

圖2 顛倒木金散治療冠心病的藥物活性成分靶點(diǎn)圖

表1 顛倒木金散的藥物活性成分表

2.4 藥物-疾病的核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖將藥物郁金-木香與冠心病的靶點(diǎn)合并取交集，得到藥物治療疾病的67 個(gè)靶點(diǎn)，將這67 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為“人”，得到藥物-疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，具體見(jiàn)圖3。圖中共有67 節(jié)點(diǎn)，106 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度10.3，節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關(guān)系。再將該結(jié)果以TSV 格式導(dǎo)出，導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2 軟件中，以Degree 值大于10 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終得到32 個(gè)核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。其中顏色越深、字體越大和面積越大代表節(jié)點(diǎn)值較高的靶點(diǎn)，其中NOS3（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）、PTGS2（環(huán)加氧酶2）可能是顛倒木金散治療冠心病的主要靶點(diǎn)，JUN(禽肉瘤病毒17 的轉(zhuǎn)化基因)、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）、NR3C1、SOD1（超氧化物歧化酶）、ESR1（雌激素受體1）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、ACHE（膽堿酯酶）、PPARG（過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ）等亦為重要的靶點(diǎn)。

2.5 GO生物過(guò)程分析將藥物治療疾病的67個(gè)靶點(diǎn)錄入David 數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行GO 分析，得到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞成分條目180個(gè)，再根據(jù)P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05進(jìn)行篩選，得到GO-BP（生物過(guò)程）7條、GO-CC（細(xì)胞成分）3 條、GO-MF（分子功能）7 條。并通過(guò)在線網(wǎng)址omicsshare（http://omicsmart.com/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。由結(jié)果可見(jiàn)，多個(gè)靶點(diǎn)的功能與冠心病的發(fā)生發(fā)展密不可分。顛倒木金散主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)藥物反應(yīng)、激活腺苷酸環(huán)化酶腎上腺素能受體、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、調(diào)節(jié)平滑肌收縮等。相關(guān)靶點(diǎn)治療冠心病的的功能主要富集在類固醇激素受體(steroid hormone receptor activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)均聚活性(protein homodimerization activity)、藥物結(jié)合(drug binding)、類固醇結(jié)合(steroid binding)、腎上腺素結(jié)合(epinephrine binding)等。見(jiàn)圖5。

表2 顛倒木金散主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

圖3 顛倒木金散-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 顛倒木金散-冠心病核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 KEGG通路富集分析將藥物作用與疾病的靶點(diǎn)錄入David 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到KEGG 通路73 條，以P≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出64 條，選取前10 條信號(hào)通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、膽堿能突觸信號(hào)通路（Cholinergic synapse）等。見(jiàn)表3。

3 討論

冠心病是危害人類健康的常見(jiàn)病，給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。畢穎斐等[5]總結(jié)中藥復(fù)方在緩解心絞痛、干預(yù)PCI 術(shù)后再狹窄、防治再灌注后無(wú)復(fù)流及在心肌梗死二級(jí)預(yù)防等方面存在一定的臨床優(yōu)勢(shì)。任毅等[6]基于數(shù)據(jù)挖掘總結(jié)出當(dāng)代名老中醫(yī)治療冠心病的核心藥物就包括了木香、郁金。馬維成[7]將70例穩(wěn)定性心絞痛患者作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)常規(guī)療法加用加味顛倒木金散能夠明顯改善患者的臨床癥狀和減少硝酸甘油的使用。王秋月等[8]研究發(fā)現(xiàn)毛郁金醇提物具有良好的改善心肌梗死再灌注損傷的作用，能清除氧自由基并減少其生成，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低心肌細(xì)胞損傷程度，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，最終達(dá)到保護(hù)和改善心臟功能。SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA 是氧自由基造成損傷的最主要因素，它不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，而且還通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用，引起細(xì)胞損傷。石冰卓等[9]則進(jìn)一步證實(shí)毛郁金醇提物可以提高SOD/MDA、GSH/MDA 值，清除氧自由基，抑制脂過(guò)氧化，并使心肌細(xì)胞腫脹和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，從而緩解心肌缺血。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂出血，繼發(fā)血小板的聚集，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]表明木香揮發(fā)油及去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯成分具有顯著的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用。

冠心病歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，其基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，根本原因在于氣血陰陽(yáng)虧虛，心氣鼓動(dòng)無(wú)力，導(dǎo)致痰濁血瘀，內(nèi)阻心脈，不通則痛[11]。齊婧等[12]基于聚類分析總結(jié)冠心病心絞痛基本中醫(yī)證候可大致分為熱毒蘊(yùn)結(jié)證、肝郁陰虛證、痰濕阻滯證、瘀血阻絡(luò)證、陽(yáng)氣虛證、心腎氣虛證6類，其中瘀血阻絡(luò)證為常見(jiàn)的證型。顛倒木金散出自于《醫(yī)宗金鑒》，主治氣、血、熱飲、老痰之胸痛。方中郁金辛散苦瀉，既能活血祛瘀以止痛，又能疏肝行氣以解郁，善治氣滯血瘀之證；木香行氣止痛，調(diào)中導(dǎo)滯。

圖5 GO分析圖

表3 顛倒木金散治療冠心病靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

本研究初步篩選出顛倒木金散治療冠心病的活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、結(jié)晶酚、丁香苷、柚皮素。植物甾醇存在于植物油的非皂化組分中，膳食中主要的植物甾醇是谷甾醇和豆甾醇，研究[13]發(fā)現(xiàn)植物甾醇能夠使膽固醇吸收降低，從而導(dǎo)致血漿膽固醇含量降低，預(yù)防心血管疾病。黃酮類化合物是公認(rèn)的天然抗氧化劑，有助于心臟保護(hù)作用，柚皮素是一種存在于柚子和柑橘類水果中的柑橘類黃酮類化合物，研究[14]發(fā)現(xiàn)柚皮素對(duì)高膽固醇血癥患者能夠降低血脂和增加抗氧化酶活性，如SOD1（超氧化物歧化酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）。過(guò)度的炎癥、氧自由基的損害可介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而這種不正常的細(xì)胞凋亡可加重缺血心肌的損傷。紫丁香苷是一種苯丙醇苷類化合物，研究[15]發(fā)現(xiàn)丁香苷可降低炎癥組織MDA 含量，提高SOD活性，起到抗氧自由基的作用，從而保護(hù)心臟。

本研究發(fā)現(xiàn)，顛倒木金散治療冠心病的靶點(diǎn)主要是NOS3 和PTGS2。NOS 包括三種同工酶:內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)型(nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。eNOS 主要通過(guò)抑制白細(xì)胞黏附及遷移、減少低密度脂蛋白氧化和抑制平滑肌細(xì)胞增殖等途徑來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[16]；iNOS 則促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。研究[17]發(fā)現(xiàn)木香的提取物去氫木香內(nèi)酯能使核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）失活而抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達(dá)，從而減少斑塊的形成。但是，木香到底是通過(guò)激活eNOS 還是通過(guò)抑制iNOS 來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，還需在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。PTGS2 在多種細(xì)胞類型如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，并被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和癌基因高度誘導(dǎo)，研究[18]發(fā)現(xiàn)PTGS2酶抑制劑能顯著縮小梗死面積，證實(shí)了PTGS2酶能夠誘導(dǎo)心肌梗死并且導(dǎo)致心肌功能障礙。

顛倒木金散治療冠心病的通路包括神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路。神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合[19]，此信號(hào)通路上的蛋白在心肌細(xì)胞和冠狀動(dòng)脈均有表達(dá)，神經(jīng)活性物質(zhì)如去甲腎上腺素激動(dòng)α受體激動(dòng)，引起心肌收縮力增強(qiáng)、心率加快[20]；再如血管緊張素（Ang）II 促進(jìn)血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，且還能介導(dǎo)血管內(nèi)皮線粒體功能障礙[21]。心肌細(xì)胞的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)與鈣離子通路有關(guān)，心肌收縮高度依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，鈣通道阻滯劑阻斷鈣離子經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜上的鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞，減少心肌收縮，減輕心絞痛的癥狀[22]。與男性相比，絕經(jīng)前女性的心血管疾病減少，但絕經(jīng)后女性心血管疾病的發(fā)病率增加，大量的研究證實(shí)可能與雌激素水平相關(guān)，雌激素可以與膜受體GPER1結(jié)合，結(jié)合后激活磷脂酰肌醇-3（PI3）激酶，進(jìn)而激活蛋白激酶B(Akt)激酶，能夠減少梗死面積，對(duì)心臟具有保護(hù)作用[23]。故推測(cè)顛倒木金散可能通過(guò)阻斷鈣離子信號(hào)通路以及激活雌激素信號(hào)通路來(lái)治療冠心病。

綜上，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法提示木香-郁金共有28個(gè)活性成分，作用于67個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)多種蛋白功能，涉及了多種通路和生物進(jìn)程，表明顛倒木金散通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多途徑治療冠心病。后續(xù)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其治療冠心病的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。