KIR MMP-9基因多態性與單純皰疹病毒1型腦炎易感性的相關性

曹 杏 沈 雷 張偉東 李 林

單純皰疹病毒屬于α皰疹病毒亞科，具有致病性，根據抗原不同，可分為單純皰疹病毒1型(herpessimplexvirus,HSV-1)和2型，90%的單純皰疹病毒性腦炎都是由HSV-1引起的。此病起病急，重癥患兒經治療后預后較差，甚至出現后遺癥，嚴重威脅患兒健康。相關研究報道，先天免疫系統在腦內病毒復制的控制過程中發揮關鍵作用，免疫失調和炎癥是HSV-1腦炎的發病機制和預后的主要決定因素。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killerIg-likereceptors,KIR)基因家族可激活先天免疫應答的自然殺傷細胞，同時免疫應答可以有效的削減HIV-1腦炎的易感性。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMP-9)在多種免疫細胞中表達，并受多種細胞因子調控。相關研究表明，MMP-9基因的異常表達與炎癥反應、免疫疾病、病毒感染等多種疾病有關，并發揮了廣泛的促進病毒復制作用。但KIR和MMP-9基因多態性對HSV-1腦炎患兒作用的具體機制尚不清楚。本研究采用序列特異引物聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)方法和聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法檢測HSV-1腦炎患兒KIR和MMP-9基因多態性的分布情況，并分析其與患兒易感性的關系，為臨床預防及診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年3月河南省南陽市中心醫院治療的HSV-1腦炎患兒75例為研究組,其中男性33例,女性42例,年齡1～11歲，平均 (6.53±3.64)歲。另選取經腦脊液檢測為非病毒性腦炎的患兒(輕型非典型病毒性腦炎)75例為對照組,其中男性36例,女性39例, 年齡1～12歲，平均 (6.79±3.82)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(

P

=0.113、0.279)，具有可比性。HSV-1腦炎患兒納入標準:①參考第7版《儲福棠實用兒科學》HSV-1腦炎診斷標準；②患兒年齡<14歲；③腦脊液HSV-1的IgM抗體為陽性，腦脊液淋巴細胞增多。排除標準:①急性細菌感染性疾病患兒；②丙肝病毒、乙肝病毒、巨細胞病毒感染的患兒。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 按照DNA提取試劑盒的操作說明進行全血DNA的提取,-80C保存待查。基因組DNA提取試劑盒購自北京宜科思源科技有限公司。

1.2.2 KIR基因多態性檢測 KIR基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，運用PCR-SSP方法檢測KIR等位基因(2DL1、2DL2、2DL3、2DL5、3DL1、3DL2、3DL3、2DL4、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5和3DS1)表達情況，具體操作按照說明書的使用說明進行嚴格操作，PCR擴增程序：95℃3 min, 92℃20 s,60℃ 20 s、70℃ 50 s，40個循環，72℃ 6 min，擴增產物采用3%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.3 MMP-9基因1562C/T多態性檢測 采用PCR-RFLP方法分析MMP-9基因1562C/T多態性，應用Primer Premier 軟件，設計引物，上游引物5’-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3’和下游引物5’-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3’, 所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，產品的長度為435 bp，PCR反應體系為模板DNA為300 ng，10×PCR Buffer 5 μL，MgCL為3 mmol，Premix Ex Taq酶為1.5 U。PCR反應條件:95℃初始變性6 min, 90℃30 s,60℃退火1 min。延伸72℃7 min，40個循環。在對PCR產物采用限制性內切酶Sph I進行酶切，酶切后的產物分析使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后436 bp一條條帶為CC基因型，194 bp和242 bp兩條條帶為TT基因型，194 bp、242 bp和436 bp三條條帶為CT基因。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0進行統計分析,計數資料采用百分比表示,使用

χ

檢驗,采用logistic回歸模型分析KIR等位基因、MMP-9基因1562C/T多態性與HSV-1腦炎易感性的關系,以

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIR和MMP-9基因多態性分布情況 研究組KIR等位基因中的2DL1和3DL1基因頻率明顯高于對照組,2DS2、2DS4、2DS5和3DS1基因頻率低于對照組(

P

均<0.05);研究組MMP-9基因1562C/T多態性中CC基因頻率低于對照組，TT基因頻率高于對照組(

P

均<0.05)。見表1。

表1 兩組KIR、MMP-9基因多態性分布情況比較[例(%)]

續表1

2.2 KIR、MMP-9基因多態性與HSV-1腦炎易感的關系 以HSV-1腦炎易感性為因變量(非易感=0，易感=1)，將兩組KIR和MMP-9基因分布比較差異有統計學意義的變量設為自變量(2DL1、3DL1、2DS2、2DS4、2DS5、3DS1、CC、TT均原值錄入)，使用 enter 法建立多因素 logistic 回歸分析模型，結果顯示,2DL1、3DS1和TT能夠增加HSV-1腦炎的易感性，2DS2、3DL1、2DS4、2DS5和CC可能作為保護因素而降低HSV-1腦炎的易感性。見表2。

表2 KIR、MMP-9基因多態性與HSV-1腦炎易感的關系

3 討論

HIV-1腦炎是由皰疹病毒感染引起的腦實質炎性反應，該病發病無年齡限制,且任何季節都可發病,前期會出現發熱、頭痛、腹痛和腹瀉等全身不適癥狀,潛伏期2～21天,病情在數日內可快速進展, 多有意識障礙,如嗜睡、昏迷或去皮質狀態,重癥患者腦部會出現壞死和腦水腫,導致顱內壓增高,致使腦疝形成,最終死亡。本病死亡率高達40%～70%，約90%的人類單純皰疹病毒性腦炎均是由1型引起。本病常引起口腔和呼吸道原發感染,沿三叉神經分支經軸索逆行至三叉神經節,以潛伏形式存在,機體免疫力低下時可誘發病毒激活。

KIR免疫球蛋白樣超基因家族通過不同的組合和結構形成了多樣性的KIR基因家族，在天然免疫和獲得性免疫中發揮重要作用。KIR主要表達在T細胞和NK細胞表面來調節NK細胞活性，在病毒感染性疾病中發揮重要作用。MMP-9基因1562C/T多態性是MMP-9基因轉錄啟動子上游的1562處存在的C被T取代，此多態性位點9 bp序列是一個重要的調控元件，是轉錄抑制蛋白的結合位點，影響了基因轉錄而產生出低活性(C/C)和高活性(C/T, T/T)的啟動子基因型，1562C/T與轉錄抑制蛋白的結合能力更強，影響了MMP-9基因轉錄的能力，進而決定了不同人群對于某些疾病具有不同的易感性。本研究結果顯示，HSV-1腦炎患兒KIR等位基因中的2DL1和3DL1基因頻率明顯高于非HSV-1腦炎患兒，2DS2、2DS4、2DS5和3DS1基因頻率低于非HSV-1腦炎患兒(

P

均<0.05)；MMP-9基因型中,HSV-1腦炎患兒CC基因頻率低于非HSV-1腦炎患兒，TT基因頻率高于非HSV-1腦炎患兒(

P

均<0.05)。

又進一步通過logistic回歸模型分析結果顯示,2DL1、3DS1和TT能夠增加HSV-1腦炎的易感性,2DS2、3DL1、2DS4、2DS5和CC可能作為保護因素而降低HSV-1腦炎的易感性,說明HSV-1腦炎患兒發病機制可能與KIR等位基因和MMP-9基因1562C/T多態性具有一定的相關性。先天性免疫系統是對病原體感染的第一反應,自然殺傷細胞(NK細胞)在這一反應中起至關重要的作用,它們能夠殺死直接感染的細胞,產生細胞因子,并與適應性免疫系統進行交互作用。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體2DL1是人體內由KIR、2DL1基因編碼的蛋白質，它是一種抑制受體，通過KIR調節NK細胞在人體免疫中的功能。KIR通過與人類白細胞抗原相互作用調節自然殺傷細胞的激活。在HSV-1腦炎患者中,這兩種白細胞抗原的高發病率似乎與有癥狀的腦炎有關,這種關聯可能與與NK細胞的抑制作用有關。NK細胞是免疫反應的重要調節因子，其功能不僅僅是殺死被感染或轉化的細胞,還與樹突狀細胞、巨噬細胞相互作用，通過影響細胞因子的產生來調節細胞活性。在NK細胞發育階段，KIR基因是唯一進行轉錄的基因。相關研究表明，KIR基因型及功能與多種病毒有關的感染性疾病的感染、進展以及轉歸關系密切。KIR基因在NK細胞抗HIV-1感染的功能性實驗中高度富集，這也與本研究中HSV-1腦炎易感性與KIR基因多態性相關基本一致。MMP-9具有降解細胞外基質和參與炎癥組織修復和重構機制的功效，MMP-9基因啟動子區域的遺傳變異可能影響其轉錄和蛋白合成,從而導致多種疾病易感性的發生。

綜上所述，KIR等位基因和MMP-9基因1562C/T多態性可能與HSV-1腦炎的易感性相關， 2DL1、3DS1和TT能夠增加HSV-1腦炎的易感性，2DS2、3DL1、2DS4、2DS5和CC可能作為保護因素而降低HSV-1腦炎的易感性，關于其具體作用機制，有待后續研究進一步探討。