不同經營強度下毛竹叢枝菌根共生體對氨氧化微生物的影響*

葛江飛，楊為中，高雄飛，孫思哲，陳俊輝，梁辰飛，徐秋芳，鄔奇峰，秦 華?

（1. 浙江省森林生態系統碳循環實驗室，浙江農林大學，浙江臨安 311300；2. 浙江農林大學環境與資源學院，浙江臨安 3113003；3. 浙江省臨安區農業技術推廣中心，浙江臨安311300）

毛竹（Phyllostachys pubescens）生長周期短、用途廣泛、經濟價值高，已經成為我國南方地區尤其是山區農民的主要經濟來源之一。近二十余年，為追求更高的經濟效益，大量毛竹林由粗放經營模式逐漸轉變為集約經營，主要措施為大量施用氮肥、深翻土壤以及林下清除灌木和雜草等，從而獲得更高的竹材和竹筍產量。集約經營模式雖然增加了農戶的經濟收益，但是大量施用氮肥也帶來了土壤酸化、微生物活性降低以及水體富營養化等一系列環境問題[1]。此外，已有學者研究發現毛竹林施肥、翻耕等集約經營措施也會導致土壤某些功能菌群如固氮菌和氨氧化微生物的群落結構發生顯著改變[2]，對土壤氮循環產生不利影響并且會加劇溫室氣體排放[3]。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是自然界分布最廣泛的一類菌根真菌，能侵染超過80%的高等陸生植物根系，幫助宿主植物提高水分及養分利用效率[4]。由于氨氧化微生物是化能自養微生物，早期研究表明，AM 真菌對土壤氨氧化微生物沒有影響[5]。但近年來有研究發現，AM 真菌可能通過與氨氧化微生物競爭土壤中的有效氮（NH4+）從而影響氨氧化微生物的豐度及群落[6-8]。Teutscherova 等[7]的室內培養實驗研究發現接種AM真菌處理的土壤中氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的豐度顯著上升，其他許多研究結果也表明AM 真菌對AOB 豐度的影響是積極的[9-11]，并且AOB 的群落結構也會因為AM 真菌的存在發生顯著的改變[12]。但也有一些研究發現AM 真菌的存在會對氨氧化微生物產生負面的影響[6，13-14]，并且這些負面的影響大多數是在土壤NH3較低的情況下發生的，如土壤肥力低或者土壤pH 較低土壤中的氨多以NH4+的形式存在，不利于被氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）或者AOB 利用。

雖然在菌根共生過程中AM 真菌與氨氧化微生物之間的養分競爭假設已成為目前較為流行的觀點，但是這些研究未將AM 真菌與根系的效果分開，因此無法準確評估AM 真菌與根系對氨氧化微生物群落演變的貢獻。此外，在不同的毛竹林經營強度下，菌根對氨氧化微生物影響如何目前尚未有明確的結論。因此，本研究利用原位微宇宙試驗，研究毛竹林生態系統中叢枝菌根及菌絲對氨氧化微生物群落的影響及其對毛竹經營強度的響應機制，為毛竹林科學合理施用氮肥，減緩全球氣候變化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于浙江省杭州市臨安區青山鎮（119°42′ E，30°14′ N），海拔50 m，屬亞熱帶季風氣候，溫暖濕潤，光照充足，年降水量1 420 mm，年均氣溫約15.6 ℃，年均無霜期約230 d，地形為低山丘陵，土壤類型為紅壤。選取集約經營毛竹林作為研究對象，同時選取附近立地條件相似的粗放經營毛竹林作為對照。集約經營毛竹林的經營措施主要是隔年采伐老竹留養新竹，去除林下灌木、雜草，并對毛竹進行鉤梢。每年6 月中下旬采用撒施的方式對毛竹林進行施肥，然后進行深翻，化肥用量為：尿素（CO（NH2）2）450 kg·hm–2、過磷酸鈣（Ca（H2PO4）2）450 kg·hm–2、氯化鉀（KCl）150 kg·hm–2。粗放經營毛竹林不施肥，隔年采伐老竹留養新竹，林下植被主要有連蕊茶（Camellia cuspidate）、狗脊蕨（Woodwardia japonica）、兔兒傘（Syneilesis aconitifolia）、絡石（Trachelospermum jasminoides）、白花敗醬草（Patriniavillosa）、寶鐸草（Disporum sessile）等。

1.2 試驗設計

于2017 年6 月分別在集約經營和粗放經營的毛竹林樣地各建立4 個10 m×10 m 的樣方，各樣方之間距離均大于30 m，共計8 個樣方。在每個樣方內設置2 個不同的微宇宙系統，共計16 個。微宇宙系統由PVC 筒（直徑16 cm，高度20 cm）和尼龍篩網制成，PVC 筒壁上開有8 個孔（4 個6 cm 孔徑和4 個3 cm 孔徑），底部開有4 個孔（6 cm 孔徑），所有的孔均安裝有不同孔徑的尼龍篩網以區分不同菌根分室處理，其中2 mm 孔徑的篩網可以使得毛竹細根及AM 真菌菌絲均能通過（+細根+AM 真菌），設為菌根室（RA）處理；35 μm 孔徑的篩網僅允許AM 真菌菌絲通過（-細根+AM 真菌），設為菌絲室（AH）處理。分層取出樣地0～20 cm 土壤，去除明顯的植物根系及石塊，放置好PVC 筒后，再盡快按照原來順序將土壤分層放入筒內。在微宇宙系統布置完成后原地培養3 個月，用土鉆采集微宇宙系統內土壤帶回實驗室進行分析。鮮土樣混合后過2 mm篩，一部分土壤立即進行DNA 提取及硝化勢的測定，另一部分風干進行理化性質分析。

1.3 土壤理化性質及硝化勢測定

土壤理化性質參照魯如坤等[15]方法：土壤有機質采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法測定；堿解氮采用堿解擴散法測定；有效磷采用鹽酸-氟化銨溶液浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用醋酸銨提取，火焰分光光度計測定；土壤pH 采用水土比2.5∶1，玻璃電極法測定。

土壤硝化勢的測定采用好氣培養法[16]并作略微修改。稱取 10 g 新鮮土樣置于錐形瓶中，加入（NH4）2SO4調節NH4+-N 濃度到400 mg·kg–1，以干土計算，將含水量調節至田間最大持水量的60%，同時以不加（NH4）2SO4溶液的土壤作為對照。將錐形瓶放于25 ℃的培養箱中避光培養48 h，培養結束后，用50 mL 1 mol·L–1KCl 溶液浸提并過濾，流動分析儀測定NO3--N 含量。

1.4 土壤DNA 提取及定量PCR

土壤總 DNA 的提取采用 MoBio PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑盒（MoBio Laboratories，美國），稱取0.5 g 冷凍干燥土壤樣品，按照試劑盒說明提取DNA。提取的DNA 片段大小經1%（m/v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用微量分光光度計（NanoDrop ND-1000，Thermo Scientific，美國）進行濃度測定，保存于–40 ℃用于后續分析。

使用CFX96TMReal-Time System（Bio-Rad）儀器進行氨氧化古菌和氨氧化細菌 amoA 功能基因實時定量分析，以確定樣品的基因拷貝數。AOA和AOB amoA 基因的PCR 擴增采用的引物對分別是Arch-amoAF：5′-A ATGGTCTGGCTTAGACG-3′/Arch-amoAR：5′-GCGGCCATCCATCTGATTGT-3′和amoA-1F：5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′/amoA-2R：5′-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC- 3′[17]，每個樣品3 個重復，反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50 μmol·L–1上游引物和下游引物各0.2 μL，DNA 模板1.0 μL，無菌水補足至20 μL。AOA 和AOB 的擴增程序見參考文獻[18]。

1.5 高通量測序及數據處理

采用帶barcode 的AOA 和AOB 特異性引物，利用Illumina Miseq 平臺進行高通量測序，測序服務委托杭州聯川生物技術有限公司完成。用QIIME2將Miseq 測序完成后得到原始的下機數據進行處理，利用overlap 將雙端數據進行拼接，并進行質控、嵌合體過濾，獲得高質量的有效數據。對最終獲得的有效數據采用Vsearch2.3.4 算法按照97%的相似度聚類，為了降低假陽性率，過濾掉singleton 序列，獲得最終的OTU 豐度及代表序列，進一步進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。

1.6 數據分析

采用SPSS19.0 對土壤理化性質、硝化勢、AOA和AOB amoA 基因拷貝數、α 多樣性指數以及優勢屬相對豐度均進行單因素方差分析（One-way analysis of variance）和雙因素方差分析（Two-way analysis of variance）比較各處理之間的差異顯著性（P＜0.05）。對土壤理化性質與AOA 和AOB 的amoA基因拷貝數進行Pearson 相關性分析。采用R 語言Vegan 包對不同處理土壤AOA 和AOB 群落結構進行非度量多維尺度轉換排序分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS），并通過相似性檢驗（Analysis of similarities，ANOSIM）檢驗不同群落之間的差異顯著性（P＜0.05）。為了進一步了解經營強度和不同分室處理對氨氧化微生物種群之間相互作用的影響，利用MENA 平臺對OTU 豐度進行網絡分析。

2 結 果

2.1 土壤理化性質及硝化勢

無論是集約經營還是粗放經營毛竹林，AH 處理土壤pH 均顯著低于RA 處理（P＜0.05）。集約經營毛竹林AH 處理土壤堿解氮也顯著低于RA 處理（P＜0.05），有機質及其他養分含量均未發生顯著變化（表1）。與不同分室處理相比，不同經營強度對土壤養分含量的影響更為明顯。集約經營毛竹林RA處理土壤有機質、pH 顯著低于粗放經營毛竹林，而堿解氮含量顯著高于粗放經營毛竹林土壤。同時，集約經營毛竹林AH 處理土壤有效磷和速效鉀含量顯著高于粗放經營毛竹林，而 pH 顯著降低（P＜0.05）。雙因素方差分析結果表明，經營強度和分室處理均顯著影響土壤pH 和堿解氮含量，但兩者沒有顯著的協同效應（表1）。

在同一類型毛竹林中，不同分室處理之間土壤硝化勢均沒有顯著差異（表1），而集約經營毛竹林RA 處理土壤硝化勢顯著高于粗放經營毛竹林（P＜0.01）。雙因素方差分析結果表明，經營強度對硝化勢影響顯著（P＜0.01），不同分室處理對硝化勢影響不顯著，但兩者對土壤硝化勢具有顯著的協同作用（P＜0.05）。

2.2 氨氧化微生物amoA 基因豐度

熒光定量PCR 結果顯示，無論是集約經營還是粗放經營，不同分室處理之間毛竹林AOA 的基因豐度均無顯著差異（圖1）。而在同一分室處理條件下，集約經營毛竹林RA 和AH 的AOA 基因豐度均顯著高于粗放經營（P＜0.05）。雙因素方差分析結果表明，經營強度對AOA 基因豐度影響顯著（P＜0.01）。

表1 毛竹林土壤理化性質及硝化勢Table1 Soil physic-chemical properties and nitrification potentials of the Moso bamboo forest relative to management intensity（mean±SD，n=3）

無論是RA 處理還是AH 處理，AOB 在不同經營強度毛竹林之間均無顯著差異（圖1）。在同一經營強度下，無論是集約經營還是粗放經營，RA 處理土壤AOB 基因豐度均顯著高于AH 處理（P＜0.05）。雙因素方差分析結果表明，經營強度和分室處理均對土壤AOB 基因豐度影響顯著（P＜0.05），兩者交互作用也達到顯著水平（P＜0.05）。

圖1 毛竹林土壤AOA 及AOB 基因豐度Fig. 1 Abundance of AOA and AOB in Moso bamboo forest soils relative to management intensity

2.3 氨氧化微生物amoA 基因豐度與土壤理化因子及硝化勢的相關性

對氨氧化微生物豐度與土壤理化因子及硝化勢的Pearson 相關性檢驗結果表明，AOA 豐度與硝化勢、堿解氮顯著正相關，與土壤pH 顯著負相關，而AOB 豐度則與土壤有機質和pH 顯著正相關（表2）。

2.4 氨氧化微生物的群落結構

集約經營毛竹林中，AH 處理AOA 的物種數顯著低于RA 處理，而粗放經營毛竹林則相反，AH 處理AOA 的物種數及α 多樣性指數均顯著高于RA 處理（P＜0.05）。兩種經營方式相比，粗放經營毛竹林AH 處理的物種數及α 多樣性指數均顯著高于集約經營毛竹林（表3）。雙因素方差分析顯示經營強度對AOA 的物種數及α 多樣性指數影響顯著，不同分室處理無顯著影響，但是兩種因素對物種數和Chao1 指數具有極顯著的交互作用（P＜0.01）。與AOA 相比，AOB 物種數及α 多樣性指數在不同經營強度和分室處理之間均無顯著差異（表3）。雙因素方差分析結果表明，僅經營強度對 AOB 群落Chao1 指數影響顯著（P＜0.05），經營強度及分室處理對 AOB 群落香農指數具有顯著的交互作用（P＜0.05）。

表2 氨氧化微生物基因拷貝數與土壤理化及硝化勢相關性分析Table2 Correlation analysis of abundance of ammonia oxidizers with soil properties and soil nitrification potential

表3 毛竹林土壤AOA、AOB 群落多樣性指數Table3 Diversity indices of the AOA and AOB communities in the Moso bamboo forest soils

ANOSIM 分析結果顯示，無論是經營強度還是不同分室處理均未對AOA 和AOB 的群落結構產生顯著影響，但在集約經營毛竹林土壤中，RA 和AH處理的AOA 群落有明顯區分。對AOB 而言，不同經營強度毛竹林AH 處理之間區分明顯（圖2）。

2.5 氨氧化微生物分子生態網絡特征

基于兩種經營強度毛竹林的分組方式，對AOA和AOB 的高通量測序數據進行網絡分析。AOA 的網絡分析結果顯示，粗放經營毛竹林網絡中節點數高于集約經營，但是連接數和正相關比例均低于集約經營（表4）。而AOB 的網絡分析結果則顯示，粗放經營毛竹林網絡中節點數和連接數均高于集約經營，但正相關比例低于集約經營毛竹林（表4）。不論AOA 還是AOB，網絡中正相關的連接數均表現出集約經營高于粗放經營的趨勢。將網絡節點與環境因子進行曼特爾相關性分析（Mantel test）發現，在每個分類水平環境因子并未對網絡中的不同物種產生顯著影響。

3 討 論

圖2 AOA、AOB 群落組成NMDS 排序圖Fig. 2 NMDS ordination plots of the community compositions of ammonia-oxidizing bacteria and archaea

表4 毛竹林土壤AOA、AOB 分子生態網絡特征Table4 The properties of the molecular ecological networks of the AOA and AOB communities in the Moso bamboo forest soils

微宇宙試驗結果表明無論是集約經營還是粗放經營毛竹林，AH 處理土壤 pH 均顯著低于 RA（P＜0.05），這與Veresoglou 等[13]的研究結果一致，主要是由于AM 菌絲體分泌的有機酸可降低土壤pH。其他學者分別以煙草和沙丁旺為宿主植物研究AM 真菌對其土壤理化性質的影響也得到了相同的結果[19-20]。集約經營毛竹林AH 處理土壤堿解氮也顯著低于RA 處理（P＜0.05）。雖然在菌根系統中，植物根系、AM 真菌以及氨氧化微生物可能會競爭土壤中的有效氮素，但在有根系存在的菌根系統中，植物根系隨時都在進行著更新和分解，產生氮素歸還到土壤[21]，而在無根系存在的菌絲室中，氮的來源補充遠少于菌根室，菌絲吸收氮素導致土壤有效氮含量降低，這可能是導致RA 處理中土壤堿解氮高于AH 處理的主要原因。

熒光定量PCR 結果表明，毛竹林經營強度對AOA 基因豐度產生了顯著的影響，對AOB 的影響不顯著，導致這一結果的原因可能是因為pH 降低影響了AOA 的豐度，相關性分析也顯示AOA 基因豐度與pH 顯著相關。Nicol 等[22]發現，AOA 基因豐度隨著土壤pH 的增加而降低 （在4.9～7.5 之間），即相較于AOB 而言AOA 在自然界中擁有更廣泛的生態位，更適于在酸性土壤條件下生存并且在酸性土壤中發揮的作用更大[23]。本研究中集約經營毛竹林大量的施肥導致土壤pH 下降，為AOA 提供了一個較為適宜的生存條件。研究結果發現不同的分室處理對AOB 影響顯著，不論是集約經營還是粗放經營，AH 處理AOB 的基因豐度均顯著減少。相反，RA 處理根系和AM 真菌共存的菌根系統中AOB 豐度更高。相關性分析顯示pH 極顯著地影響了AOB的豐度，并且AH 處理土壤pH 變化規律與AOB 豐度一致。因此，AH 處理AOB 豐度均顯著減少可能是因為AM 真菌菌絲通過降低pH 間接地影響了AOB，較低的pH 會降低AOB 底物的利用效率[24]。這一結果與Teutscherova 等[7]的盆栽結果一致，AM真菌與植物共生對AOA 的豐度沒有顯著的影響，但是卻顯著提高了AOB 的豐度。除此之外，在RA 處理中植物根系與AM 真菌共生也會使得土壤孔隙度增加，根系分泌物和菌絲分泌物的雙重作用會增加土壤團聚體含量使得土壤更疏松[25]。鑒于AOB 為一類好氧氨氧化微生物，疏松的土壤環境更有利于AOB 的生存。雖然經營強度和分室處理分別對AOA和AOB 的豐度產生了顯著的影響，但對AOA 和AOB 群落結構影響并不顯著。Cavagnaro 等[5]在2007年對一有機農場的AOB 的研究結果也發現，AM 真菌并沒有對其群落組成和結構產生顯著的影響，其原因可能是因為研究時間相對較短導致差異性不顯著。此外，AOA 和AOB 的群落結構對土壤理化因子的響應非常復雜，其群落結構的變化取決于多種因子的綜合效應，這也是本研究中集約經營導致的土壤性質變化僅僅改變了AOA 和AOB 的基因豐度，而對其群落結構并未產生顯著影響的可能原因。

近年來，分子生態網絡已經被廣泛應用于了解微生物種間交互多樣性及其生態系統穩定性[26]。本研究中對網絡節點數（Total nodes）、連接數（Total links）、平均度（Average degree）的對比分析均發現AOA 網絡中集約經營連接數和平均度大于粗放經營，說明集約經營毛竹林AOA 分子生態網絡中物種豐富程度、物種交互復雜性高于粗放經營。AOB網絡中，粗放經營網絡節點數、連接數、平均度三項指標的值均大于集約經營，說明粗放經營毛竹林AOB 生態網絡的物種豐富度、物種交互復雜性優于集約經營，這也說明了AOA 和AOB 在土壤中具有不同的生態位，對環境的響應具有較大的差異。網絡中連接的正負相關性可以用于推斷微生物之間的相互關系，正相關代表生態位一致或共生關系，微生物共建生物膜或者交換代謝產物，負相關代表著競爭或捕食[26]。本研究構建的四個生態網絡中，網絡節點連接之間均以正相關為主，表明AOA 和AOB的微生物之間合作關系大于競爭關系，并且AOA和AOB 的生態網絡均表現出集約經營的正相關關聯大于粗放經營，表明集約經營毛竹林中AOA 和AOB 存在更多的共生關系，而粗放經營毛竹林中氨氧化微生物之間的競爭更為激烈，可能是由于土壤養分供應少于集約經營。集約經營中氨氧化微生物之間的互作和共生關系較粗放經營更加緊密，而粗放經營毛竹林中氨氧化微生物之間的競爭比集約經營激烈，造成這一結果的原因可能是因為毛竹林集約經營過程中施肥增加了土壤中的氮素含量，一定程度上緩解了氨氧化微生物之間的養分競爭。

4 結 論

無論毛竹林經營強度如何AM 真菌菌絲均顯著降低了土壤pH，且在集約經營毛竹林中AM 真菌菌絲顯著降低了土壤堿解氮含量。不同菌根分室處理并未對硝化勢產生顯著影響，但經營強度影響顯著。集約經營和AM 真菌菌絲分別對AOA 和AOB 基因豐度影響顯著，雖然兩者對氨氧化微生物群落結構沒有顯著影響，但分子生態網絡分析顯示集約經營緩解了氨氧化微生物之間的養分競爭。