厚樸酚通過PD-1/PD-L1通路介導非小細胞肺癌增殖和凋亡的機制研究

史紅陽,王 煜,張永紅,鄧文靜,李 維

(西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:shihy2003@126.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌的85%-90%,是與癌癥相關死亡的主要原因[1]。近幾十年來,NSCLC的診斷和治療策略有了很大的進步,但NSCLC的預后仍然較差,5年總體生存率仍低于15%[2]。程序性死亡受體1(programmed death-1,PD1)是CD28家族成員之一,是一種參與維持外周耐受性的抑制受體,PD-1通過招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,阻斷CD3/CD28誘導的PI3K活化和TCR下游的其他信號事件,最終抑制T細胞增殖、細胞因子的產生和分化[3,4]。PD-1免疫檢查點是免疫系統重要的穩態機制,有助于預防慢性感染患者的自身免疫和炎癥失控,然而,PD-1/PD-L1信號通路也被多種惡性腫瘤所控制,是腫瘤細胞逃避免疫系統監控的最重要機制之一[5]。厚樸是我國傳統中藥,基本上全身皆可入藥,在我國分布廣泛。厚樸中含揮發性油、生物堿及微量鹽酸等,其中和厚樸酚與厚樸酚作為其主要成分被廣泛研究,主要具有抗菌、抗病毒以及抗腫瘤的功能[6]。本研究探討厚樸酚通過PD-1/PD-L1信號通路介導非小細胞肺癌增殖和凋亡的機制研究,為厚樸酚抗癌作用的臨床運用提供前期工作基礎和理論支持。

1 材料和方法

1.1 細胞株和組織樣本

人肺癌細胞系A549和人支氣管上皮樣細胞HBE(陰性對照)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。收集本院2017年8月至2018年5月經臨床和病理確診的NSCLC組織標本30例,收治患者在癌組織切除手術前無其他全身器質性病變并未接受化療等治療,同時收集距離肺癌組織7 cm以上的肺黏膜組織為癌旁對照組,收集的癌組織和癌旁組織經液氮處理后凍存在-80 ℃冰箱盡快用于后續試驗。研究取得本院倫理委員會的論證許可(NO.2018-3-5-012),而且患者簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑

DMEM細胞培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司,PBS緩沖液和胰酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司,RNeasy Mini kit試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司,PD-1、PD-L1、18S rRNA引物由上海生工合成,Cell Lysis Buffer、PD-1 Rabbit mAb、PD-L1 Rabbit mAb購自美國CST公司,CCK8試劑盒購自日本同仁化學,Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.3 細胞培養

把人非小細胞肺癌細胞A549凍存管和人支氣管上皮樣細胞HBE于37 ℃水浴鍋解凍,吸取細胞懸浮液移入事先準備好的15 ml離心管中,加入5 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養基混勻,在200g下離心4 min,吸掉上清,加入1 ml培養基反復吹打均勻后轉移至加入10 ml預熱培養基的培養瓶于37 ℃、5% CO2培養過夜,棄上清液,用PBS洗滌細胞2次,每2 d換1次培養基,細胞匯合至80%以上后倒掉培養液,加入1 ml胰酶消化液(0.25%胰酶+0.02% EDTA)消化液,吸掉消化液,顯微鏡下發現胞質回縮后加入5 ml預熱的培養基,用玻璃吸管吹打均勻,吸取一半細胞懸浮液轉移至新的培養瓶,加入8 ml培養基后于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.4 實驗分組與處理

收集對數生長期的A549細胞接種于96孔板,調整細胞濃度至1×104/孔,將細胞分為3組:對照組(0 μmol/L厚樸酚),低劑量(40 μmol/L)厚樸酚組,高劑量(80 μmol/L)厚樸酚組。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養用于后續實驗,人支氣管上皮樣細胞HBE為陰性對照組。

1.5 免疫組化

使用Max Vision法進行免疫組化。將組織切片后,進行常規脫蠟、水化以及抗原修復處理,于37 ℃中進行一抗孵育2 h后,再孵育二抗30 min,使用DAB對組織進行顯色5-10 min,再用蘇木素復染(2 min),使用PBS緩沖液作為陰性對照。

1.6 PD-L1和PD-1基因real-time RT-PCR分析

取-80 ℃冰箱組織標本,加入液氮研磨,采用RNeasy Mini kit試劑盒從肺癌組織中提取總RNA,然后用PrimeScript RT Master mix進行逆轉錄,嚴格按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書對生成的cDNA進行熒光實時PCR分析。PD-L1基因正反引物分別為5′-CATGACACA CCACCACCAGAGA-3′和5′-GGCATATAGAGGGCTCCACAA-3′,PD-1基因正反引物分別為5′-CCCCAAGGAAAAATCGAGGAG-3′和5′-GGGCGAGGGGCTGGGATATCT-3′,18S rRNA正反引物分別為5′-ACTACACACACCACCCA-3′和5′-ACACACACACACCCCCCA-3′。以18S rRNA為內參,根據Ct值計算相對表達量。

1.7 Western blot檢測腫瘤細胞中PD-1、PD-L1蛋白表達豐度

取-80 ℃冰箱組織標本,室溫解凍后PBS沖洗去除結締組織,加入Cell Lysis Buffer,勻漿研磨后收集細胞蛋白樣品,定量后取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜,采用5%脫脂奶粉封閉1 h后分別加入(1 ∶500)稀釋的PD-1 Rabbit mAb、PD-L1 Rabbit mAb,4 ℃孵育過夜。洗滌后加入HRP標記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h后洗滌添加顯色液,拍照后進行灰度值統計分析。

1.8 MTT法檢測細胞增殖

取37 ℃、5% CO2培養箱培養的96孔板,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/L)混勻繼續培養4 h后終止培養,小心吸棄孔內上清夜,加入DMSO溶液150 μl/孔,震蕩混勻,使晶狀物充分溶解。選擇波長570 nm,在30 min內于全自動酶標儀測定各孔吸光度值(A),分別檢測0,24,48,72 h時細胞的吸光值。以所測A值為縱坐標,時間為橫坐標繪制細胞增殖曲線。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測肺癌細胞A549細胞凋亡情況。取培養48 h后的3組細胞,離心洗滌后按照試劑盒說明書重懸細胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC震蕩混勻,室溫避光條件孵育20 min,然后再加5 μl PI染液,孵育5 min,立即上機檢測。激發波長Ex=488 nm,發射波長Em=530 nm,細胞凋亡率為早期凋亡(Q4)和晚期凋亡(Q2)細胞所占的比例數總和。

1.10 統計分析方法

2 結果

2.1 PD-1、PD-L1 mRNA在肺癌組織中的表達

通過real-time RT-PCR法檢測了30例肺癌組織和癌旁組織中PD-1、PD-L1 mRNA的表達情況。結果顯示,肺癌組織中PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA的表達均高于癌旁組織,差異均具有統計學意義(PD-1 mRNA:t=62.381,P=0.005;PD-L1 mRNA:t=47.971,P=0.008,見圖1)。

與癌旁組織比較,* * P <0.01圖1 PD-1、PD-L1 mRNA在肺癌組織的表達豐度Figure 1 Expression of PD-1 mRNA and PD-L1 mRNA in lung cancer tissues

2.2 PD-1、PD-L1蛋白在肺癌組織中的表達

Western blot檢測腫瘤細胞中PD-1、PD-L1蛋白表達豐度,結果顯示,PD-1、PD-L1蛋白在肺癌組織的表達均高于癌旁組織,差異均具有統計學意義(PD-1蛋白:t=65.642,P=0.005;PD-L1蛋白:t=61.253,P=0.006,見圖2)。

2.3 厚樸酚下調肺癌細胞A549 PD-L1的表達

低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組蛋白的表達水平要低于對照組,差異具有統計學意義(低劑量組vs對照組:t=93.215,P=0.003;高劑量組vs對照組:t=58.32,P=0.008);低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組間PD-L1的表達,差異無統計學意義(P>0.05,見圖3)。

與癌旁組織比較,* * P <0.01圖2 肺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的表達Figure 2 Expression of PD-1 and PD-L1 proteins in lung cancer tissues

與對照組比較,* * P <0.01圖3 不同處理后PD-L1在肺癌細胞A549中的表達Figure 3 Comparison of the expression of PD-L1 protein in A549 cells among different groups

2.4 厚樸酚抑制肺癌細胞A549細胞活力

與對照組相比,48 h和72 h時低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組肺癌細胞A549的吸光值顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 不同劑量厚樸酚對肺癌細胞A549細胞增殖的影響

2.5 厚樸酚誘導肺癌細胞A549細胞凋亡

流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡的結果顯示,對照組、低劑厚樸酚組及高劑量厚樸酚組肺癌細胞A549凋亡率分別為(1.21±0.15)%,(22.34±0.16)%和(19.13±0.12)%。與對照組比較,低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組的凋亡率升高,差異具有統計學意義(低劑量組vs對照組:t=77.182,P=0.005;高劑量組vs對照組:t=96.047,P=0.003,見圖4)。

圖4 厚樸酚對不同組肺癌細胞A549細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of magnolol on apoptosis of lung cancer cells A549

3 討論

厚樸酚是我國傳統中藥厚樸的主要活性成分之一,主要藥理作用就是抗腫瘤,其抗腫瘤機制主要包括誘導腫瘤細胞的凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉移、逆轉腫瘤細胞抗藥性等。越來越多的證據表明,PD-L1在許多類型的人類癌癥中得到表達,包括非小細胞肺癌[7-10]。PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑對多種惡性腫瘤均有療效,被認為是NSCLC的標準治療模式[11]。本文的研究結果提示厚樸酚具有抑制肺癌細胞A549增殖、促進其凋亡的作用,其機制可能是厚樸酚下調PD-L1的表達參與調控PD-1/PD-L1信號通路。

通過免疫組化的方法揭示PD-L1蛋白的陽性細胞主要定位在癌細胞和癌間質細胞的胞質和胞膜,而PD-1蛋白則主要定位在淋巴細胞胞質和胞膜[12],本研究采用RT-PCR以及Western blot檢測了PD-L1和PD-1在肺癌組織和癌旁組織中的表達豐度,而在肺癌細胞A549中我們只檢測了PD-L1的表達水平,PD-L1和PD-1在肺癌組織的表達與上述通過免疫組化的方法得到的結果是一致的。研究報道PD-L1在急性髓系白血病[13]、多發性骨髓瘤[14]、淋巴瘤[15]、間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤[16]中的表達是通過MEK-ERK或STAT3信號通路誘導的,在實體腫瘤中PD-L1的表達也被發現由于磷酸酶和緊張素同源物的功能障礙而激活PI3K-AKT通路而增加[17,18],本研究接下來將要論證PD-L1的上游調控通路以作為厚樸酚抗腫瘤機制的詳細分子基礎。王英澤等[19]發現一種由黃芪、金銀花、野菊花、鬼針草、半枝蓮以及甘草組成的中藥復方可以下調脾臟淋巴細胞PD-1的表達,而對PD-L1的表達無明顯影響。本研究發現厚樸酚可以下調肺癌細胞A549 PD-L1的表達,而厚樸酚對PD-1表達的影響未知,后續本研究將構建小鼠肺癌模型以探討厚樸酚對PD-1表達的影響。PD-1或PD-L1的表達下調可以促進體內T細胞的活性從而促進T細胞介導的抗腫瘤免疫,減少腫瘤細胞的逃逸反應[20],我們采用低、高劑量的厚樸酚作用肺癌細胞發現厚樸酚下調PD-L1的表達,同時也檢測了厚樸酚對肺癌細胞增殖和凋亡的影響,結果發現厚樸酚抑制肺癌細胞A549增殖并促進凋亡,提示厚樸酚抗腫瘤的作用可能是通過下調PD-L1的表達參與PD-1/PD-L1通路來實現的。細胞凋亡是由caspase蛋白水解酶參與的一系列級聯反應的結果,厚樸酚可能通過下調PD-1/PD-L1發出凋亡誘導信號激活caspase級聯反應,其具體機制仍需進一步的實驗論證。

綜上,厚樸酚可以下調肺癌細胞A549 PD-L1的表達,通過調控PD-1/PD-L1信號通絡抑制肺癌細胞增殖并促進凋亡,本研究為我國傳統中藥厚樸酚用于治療NSCLC提供了實驗基礎和理論支持,但其調控PD-1/PD-L1表達的具體機制以及下游調控細胞增殖和凋亡的具體機制仍需展開進一步的研究。