四氫姜黃素對膿毒血癥小鼠心肌損傷的保護作用及其機制

王 偉,曾廣偉,廉 誠,劉 慧,張曉東,安慧仙,高 釗,方 東,張艷濤,樊貝貝,孫夢娜,李 煒*

(1 西安國際醫學中心醫院心臟內科,西安 710100;2 空軍軍醫大學第二附屬醫院心內科;*通訊作者,E-mail:liweiafmu@126.com)

膿毒血癥是臨床上常見的危重病癥之一,其主要特征是血液微生物感染機體后分泌大量內毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的全身炎癥反應綜合征,如未經有效治療可進展為多器官功能衰竭,直至患者感染性休克死亡[1]。近年來內毒素對心臟的損害作用引起了廣泛關注,心肌損傷及心臟功能障礙在膿毒血癥早期即已存在,并且顯著增加患者的死亡率[2,3]。目前尚無特異性的心臟保護藥物改善膿毒血癥的心臟并發癥,因此,深入探究膿毒血癥心肌損傷機制并制定有效的防治措施是臨床上亟待解決的關鍵問題。

四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin,THC)是由姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素在體內的主要代謝產物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[4]。以往有研究表明,THC在減輕多柔比星心臟毒性、心肌細胞缺血/再灌注損傷、病理性心肌肥厚和動脈粥樣硬化等心血管疾病中均發揮了積極作用[5-8]。然而,THC能否抑制LPS誘導的小鼠膿毒癥心肌損傷尚未見相關報道,并且THC減輕膿毒血癥小鼠心肌損傷的分子機制也有待進一步探究。近年來發現,一種心腦血管疾病的明星保護分子SIRT1參與了膿毒血癥心肌損傷發生過程中炎癥、氧化應激和能量代謝等多種病理生理改變[9]。因此,本研究擬通過腹腔注射LPS法構建小鼠膿毒血癥心肌損傷模型,旨在探討THC對膿毒血癥心肌損傷的保護作用并闡明其分子機制是否通過激活SIRT1信號通路實現。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為以下4組(每組10只):對照(control)組、LPS組、LPS+THC組及EX527+LPS+THC組。通過1次腹腔注射LPS(10 mg/kg,溶于生理鹽水)建立膿毒血癥小鼠心肌損傷模型[10];control組小鼠腹腔注射同等體積的生理鹽水。control組和LPS組小鼠每日給予等量生理鹽水灌胃處理一次;在LPS注射前7 d,LPS+THC組及EX527+LPS+THC組小鼠每日給予THC[100 mg/(kg·d)]灌胃一次共7 d,EX527+LPS+THC組小鼠在藥物灌胃處理的同時給予5 mg/kg的EX527腹腔注射處理一次。

1.2.2 心臟功能檢測 待實驗完成后,異氟烷麻醉小鼠并將其置于恒溫檢測平板上,用VisualSonics Vevo 770系統和30 MHz超聲探頭進行超聲心動檢測,通過Vevo分析軟件計算左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 心肌損傷特異性標志物測定 待實驗完成后,處死小鼠,腹主動脈取血并靜置、離心分離血清,采用酶學速率法測定CK、CK-MB和TnI,根據吸光度值計算出各酶的活性。

1.2.4 心肌組織SOD活性和MDA含量測定 待實驗完成后,迅速摘下小鼠心臟,并用生理鹽水制備成組織勻漿。嚴格按照試劑盒說明書測定心肌組織中氧化應激標記物SOD活性和MDA的含量。

1.2.5 心肌組織IL-1β和TNF-α表達水平測定 按1.2.3步驟用生理鹽水制備小鼠心臟組織勻漿,嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測心肌組織中IL-1β和TNF-α的表達水平。

1.2.6 心肌組織DHE染色 待實驗完成后,迅速摘下小鼠心臟凍于液氮中,并制成5 μm厚度的冰凍切片。嚴格按照試劑盒說明書對組織切片進行DHE染色,用Olympus激光共聚焦顯微鏡拍攝照片,并使用Image-Pro Plus軟件測定其中的乙錠熒光來比較各組小鼠心肌組織內活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成量。

1.2.7 心肌組織中性粒細胞染色 待實驗完成后,迅速摘下小鼠心臟用4%多聚甲醛固定并制成石蠟切片,將制備好的心臟石蠟切片經脫蠟復水和PBS液洗滌后,孵育于MPO單克隆抗體中4 ℃過夜,以MPO表達陽性表示中性粒細胞在各組心肌組織中的浸潤情況。

1.2.8 心肌組織TUNEL染色 將1.2.6中制備好的心臟石蠟切片經脫蠟、復水、蛋白酶K溶液打孔操作后,按照TUNEL試劑盒說明書進行染色,并用激光共聚焦顯微鏡拍照并使用Image-Pro Plus軟件分析。心肌細胞凋亡率=TUNEL染色陽性心肌細胞數目/心肌細胞總數×100%。

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1.2.9 Western blot檢測SIRT1、Ac-foxo1和gp91phox蛋白表達 各組小鼠心肌組織經裂解、離心、加上樣緩沖液、煮沸等操作后,得到蛋白樣本,并通過電泳、轉膜、封閉等步驟后于4 ℃下用抗SIRT1(1 ∶1 000)、Ac-foxo1(1 ∶500)、gp91phox(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)的抗體孵育過夜。繼而在辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標記的二抗中(1 ∶1 000)室溫孵育1 h。使用Bio-Rad顯像系統檢測蛋白條帶并用Image Lab軟件進行定量分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠心肌損傷標志物比較

LPS注射后6 h檢測小鼠心肌損傷特異性標志物活性顯示,與control組相比,LPS組小鼠的血清CK、CK-MB和TnI活性均顯著升高(P<0.01);給予THC處理后,與LPS組相比,LPS+THC組小鼠的血清CK、CK-MB和TnI活性均顯著減低(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥心肌損傷的保護作用則被明顯逆轉(P<0.01,見表1)。

表2 小鼠血清中CK、CK-MB和TnI水平比較

2.2 各組小鼠心臟功能相關指標比較

LPS注射6 h后檢測小鼠心臟功能指標顯示,與control組相比,LPS組小鼠的LVEF和LVFS均顯著降低(P<0.01);與LPS組相比,給予THC處理后,LPS+THC組小鼠的LVEF和LVFS值均顯著升高(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥心臟功能的保護作用則被明顯逆轉(P<0.01,見圖1)。

2.3 各組小鼠心肌組織氧化應激損傷相關指標比較

LPS注射6 h后檢測小鼠心肌組織氧化應激相關指標顯示,與control組相比,LPS組小鼠心肌組織中SOD的水平顯著降低,脂質過氧化指標MDA的含量顯著升高,gp91phox的蛋白表達明顯增加(P<0.01),且ROS的生成量也顯著上升;與LPS組相比,給予THC處理后,LPS+THC組小鼠心肌組織中SOD水平顯著增加,MDA含量顯著降低,gp91phox的蛋白表達明顯下降,且ROS的生成也被顯著抑制(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥小鼠心肌組織氧化應激損傷的保護作用則被明顯逆轉(P<0.01,見圖2)。

與control組相比,##P <0.01;與LPS組相比,* * P <0.01;與LPS+THC組相比,&&P <0.01圖1 各組小鼠心臟功能相關指標比較Figure 1 Comparison of myocardial function between groups

與control組相比,##P <0.01;與LPS組相比,* * P <0.01;與LPS+THC組相比,&&P <0.01圖2 各組小鼠心肌氧化應激水平比較Figure 2 Comparison of myocardial oxidative stress indexes between groups

2.4 各組小鼠心肌組織炎癥反應相關指標比較

LPS注射6 h后檢測小鼠心肌組織炎癥反應相關指標顯示,與control組相比,LPS組小鼠心肌組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量顯著增加,心肌組織中性粒細胞浸潤明顯上升(P<0.01);與LPS組相比,給予THC處理后,LPS+THC組小鼠心肌組織中IL-1β和TNF-α的含量顯著降低,心肌組織中性粒細胞浸潤程度明顯下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥小鼠心肌組織炎癥反應的抑制作用則被明顯逆轉(P<0.01,見圖3)。

與control組相比,##P <0.01;與LPS組相比,* * P <0.01;與LPS+THC組相比,&&P <0.01圖3 各組小鼠心肌組織炎癥反應相關指標比較Figure 3 Comparison of the inflammatory response-related indicators in myocardial tissue between groups

2.5 各組小鼠心肌細胞凋亡水平比較

LPS注射6 h后檢測小鼠心肌細胞凋亡水平顯示,與control組相比,LPS組小鼠心肌細胞凋亡水平明顯上升(P<0.01);與LPS組相比,給予THC處理后,LPS+THC組小鼠心肌細胞凋亡水平明顯下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥小鼠心肌細胞凋亡的抑制作用則被明顯逆轉(P<0.01,見圖4)。

2.6 各組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達比較

LPS注射6 h后檢測小鼠心肌組織檢測SIRT1蛋白表達情況顯示,與control組相比,LPS組小鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯下降,Ac-foxo1的表達水平明顯升高(P<0.01);與LPS組相比,給予THC處理后,LPS+THC組小鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯升高,Ac-foxo1的表達水平明顯下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC組小鼠中THC對膿毒血癥小鼠心肌組織SIRT1信號表達的促進作用則被明顯逆轉(P<0.01,見圖5)。

3 討論

膿毒血癥是一種由病原微生物感染引起,最終導致機體多器官功能衰竭的疾病綜合征,嚴重的膿毒血癥和感染性休克是危重患者救治過程中的重要醫療問題[11]。心臟是膿毒血癥狀態下的主要受累器官并且后果嚴重,其對心肌損傷的程度是患者預后的關鍵[12]。膿毒血癥心肌損傷可表現為不同類型的心功能障礙,引起射血分數下降,心輸出量不足,顯著增加膿毒血癥患者的死亡風險[13]。本研究同樣觀察到內毒素脂多糖誘導的小鼠膿毒血癥模型中其心肌損傷明顯,表現為LPS組小鼠的血清中CK、CK-MB和TnI活性均顯著升高,同時其心臟功能也嚴重受損,表現為LPS組小鼠的左心室射血分數和左心室短軸縮短率均顯著降低。因此,尋找能緩解膿毒血癥心肌損傷的保護性藥物對于提高膿毒癥患者的生存率具有非常重要的臨床意義。

圖4 各組小鼠心肌細胞凋亡水平比較Figure 4 Comparison of cardiomyocyte apoptosis between groups

與control組相比,##P <0.01;與LPS組相比,* * P <0.01;與LPS+THC組相比,&&P <0.01圖5 各組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達比較Figure 5 Comparison of the expressions of SIRT1 protein in myocardial tissue between groups

目前對于膿毒血癥時心肌損傷的具體作用機制尚未完全闡明,近年來研究發現,炎癥反應和氧化應激損傷在膿毒血癥心肌損傷的發病過程中起到關鍵作用。促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β以自分泌和旁分泌的方式觸發炎癥級聯反應,對心肌產生負性作用,導致膿毒癥心肌損傷而最終出現心功能障礙[14,15]。并且,在識別微生物產物和宿主防御感染過程中起到重要作用的Toll樣受體的失調也可通過提高心肌組織和血清中炎癥因子水平和增強嗜中性粒細胞遷移,增強機體炎癥反應,進而促進膿毒血癥的心臟功能障礙[16,17]。同時,在膿毒血癥狀態下,機體氧化與抗氧化狀態嚴重失衡,大量線粒體和非線粒體來源的活性氧簇可通過直接損傷心肌細胞的膜結構及細胞器,導致功能障礙甚至使細胞自溶對心臟造成損傷[18,19]。此外,氧化應激損傷與炎癥反應一方面相互促進,一方面又可觸發調亡效應,引起心肌細胞凋亡,損害心肌細胞功能[20]。本研究同樣觀察到,LPS可明顯增加心肌組織內MDA含量和ROS的生成,并降低SOD的含量,上調gp91phox蛋白的表達;同時LPS組小鼠心肌組織中性粒細胞浸潤明顯增強,炎癥因子IL-1β和TNF-α的產生顯著增加,繼而導致LPS組小鼠心肌細胞凋亡率明顯上升。因此,尋找有效的抗氧化應激與抗炎治療措施可能是減輕膿毒血癥小鼠心肌損傷的有效策略。

近年來,一種具有多重藥理活性、對多種心血管疾病具有治療和預防作用的物質四氫姜黃素日益受到關注[21]。陳旭等[5]研究發現,四氫姜黃素通過抑制氧化應激損傷和凋亡改善多柔比星急性心臟毒性。馮建梅等[6]研究結果證實,四氫姜黃素預處理可通過降低氧化應激和凋亡,最終減輕心肌細胞缺血/再灌注損傷。江麗青等[7]研究結果表明,四氫姜黃素可以明顯改善2型糖尿病小鼠糖脂代謝異常,并發揮大血管保護作用。曹星等[8]觀察到四氫姜黃素能夠有效減輕壓力負荷引起的病理性心肌肥厚。然而,四氫姜黃素能否減輕膿毒血癥小鼠心肌損傷及其作用機制均有待進一步探究。本研究結果發現,與LPS組小鼠相比,給予四氫姜黃素處理可以明顯降低LPS+THC組小鼠心肌細胞的MDA含量并增加SOD含量,抑制蛋白gp91phox的表達和ROS的生成;同時四氫姜黃素處理可以顯著抑制LPS+THC組小鼠心肌組織中性粒細胞浸潤和炎癥因子IL-1β和TNF-α的產生,進而減輕了心肌組織氧化應激損傷與炎癥反應,降低了心肌細胞的凋亡,保護了小鼠的心臟功能。綜上,我們進一步證實了,四氫姜黃素同樣具有抗膿毒血癥小鼠心肌損傷的保護效應,其作用機制與抗氧化和抗炎活性密切相關。

SIRT1是sirtuin家族的成員之一,其特征是具有高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結合催化結構域,被認為在多種心血管疾病的發展和治療中發揮有益作用[22]。越來越多的研究也指出SIRT1可能參與膿毒血癥心肌損傷發生過程中炎癥、氧化應激和能量代謝的改變[9,23]。尤其值得關注的是,激活SIRT1信號在減輕膿毒血癥心肌損傷中發揮了重要角色[24-27]。此外研究報道,SIRT1可以與下游分子foxo1結合并參與foxo1的去乙酰化。foxo1分子去乙酰化后可以抑制炎癥因子及凋亡相關分子的表達,并且增加SOD等抗氧化劑的合成,進而發揮了SIRT1分子的細胞保護作用[28,29]。本研究同樣觀察到,與control組相比,LPS組小鼠心肌組織中SIRT1信號顯著被抑制,foxo1的乙酰化程度明顯增高,給予四氫姜黃素處理可以明顯提高LPS+THC組小鼠心肌組織內SIRT1信號的表達,降低了foxo1的乙酰化程度,進而介導了四氫姜黃素的抗炎、抗氧化和抑制凋亡的作用,減輕了小鼠膿毒血癥心肌損傷;而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則明顯逆轉了THC對LPS心肌損傷的保護效果。

綜上所述,本研究發現四氫姜黃素可以通過激活SIRT1信號通路抑制膿毒血癥小鼠心肌炎癥反應和氧化應激損傷,減輕心肌細胞凋亡,進而保護了心臟功能。本研究首次證實了四氫姜黃素可能是減輕膿毒血癥心肌損傷新的有效措施,為臨床上應用四氫姜黃素治療膿毒血癥心臟并發癥的患者提供了新的理論依據。