二甲雙胍在對乙酰氨基酚誘導小鼠急性肝損傷中的保護作用

常虎林,房國棟,萬 永,劉司南,張靖垚,耿西林*

(1 西安交通大學第三附屬醫院肝膽外科,西安 710068;2 西北工業大學附屬醫院肝膽外科;3 西安交通大學第三附屬醫院病理科;4 西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科;*通訊作者,E-mail:gengxilin-xa@163.com)

對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)是一種臨床上廣泛應用的解熱鎮痛藥,治療劑量下APAP安全可靠[1]。近年來,由其過量或不當應用引發的肝臟毒性損傷正呈上升趨勢,成為藥物誘導肝損傷及急性肝功能衰竭的主要原因[2]。據統計在美國約一半的急性肝衰竭是由APAP服用過量引起的,我國急性藥物性肝損傷住院患者也逐年遞增[2]。臨床上有洗胃、APAP解毒劑應用、營養支持等治療方式,嚴重者考慮肝移植。現有研究結果表明,高劑量的APAP會使葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑飽和,產生過量的NAPQI[3],超出體內還原型谷胱甘肽(GSH)系統的清除能力,從而反應性增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累,觸發c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的磷酸化,JNK的持續激活在APAP誘導肝細胞死亡中起到核心作用[4]。

二甲雙胍(metformin, MET)是目前臨床常用的治療2型糖尿病的藥物之一。近年來的研究還發現MET可用于多囊卵巢綜合征、肥胖、心力衰竭和高血壓等疾病的治療[5]。同時,有報道稱MET對非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、CCl4或甲氨蝶呤引起的肝中毒反應均有保護作用[5-9]。但是,MET對APAP誘發的急性藥物性肝損傷是否發揮保護作用尚待研究。

本研究中,我們應用APAP肝損傷動物模型,研究了MET對APAP誘導的急性肝損傷的保護作用,并初步探索了這種保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

6-8周C57BL/6雄性小鼠由陜西省人民醫院實驗中心提供。二甲雙胍(格華止,國藥準字H20023371),由上海施貴寶制藥有限公司提供。JNK羊抗鼠單克隆抗體和p-JNK羊抗鼠單克隆抗體由北京博奧森生物技術有限公司提供;TNF-α和IL-6檢測試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技術有限公司提供。APAP溶液的配制(將0.7 g APAP粉劑溶于100 ml生理鹽水中,在40 ℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻,按350 mg/kg劑量給藥準備)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作和實驗分組 6-8周齡BALB/c雄性小鼠(22-25 g)30只隨機平均分為3組:①空白對照組(control組);②藥物性肝損傷組(APAP組),腹腔內注射350 mg/kg APAP溶液,作用24 h;③二甲雙胍處理組(APAP+MET組),于APAP暴露前30 min腹腔注射MET 400 mg/kg,后給予APAP溶液,作用24 h;各組小鼠均在APAP暴露24 h后處死,及時采集血液樣本和肝組織樣本。

1.2.2 血清ALT、AST水平的測定 根據谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒,測定血清ALT、AST水平。

1.2.3 肝組織病理學檢查 取出分離后的肝臟組織利用4%甲醛溶液固定,常規蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肝組織病理學改變。

1.2.4 炎癥相關因子的測定 根據ELISA檢測試劑盒說明書指示,測定血清TNF-α、IL-6含量。

1.2.5 c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表達測定 精密稱取各組小鼠肝組織,根據RIPA裂解液使用說明書制備肝組織勻漿,肝組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨。在冰上裂解25 min后,14 000g離心30 min,取上清,利用Western blot檢測各組小鼠肝組織p-JNK/JNK(稀釋比1 ∶800)表達的變化,應用β-actin作為內參校正。

2 結果

2.1 MET對APAP誘導急性肝損傷小鼠AST、ALT的影響

與對照組相比,APAP組小鼠血清AST和ALT水平顯著升高,差異均有統計學意義(t分別為19.95,11. 16,均P<0.05)。而APAP+MET組AST、ALT水平明顯低于APAP組,差異均有統計學意義(t分別為12.31,12.83,P<0.05,見圖1)。

2.2 MET對APAP誘導急性肝損傷肝組織病理改變的影響

與對照組相比,APAP誘導肝損傷小鼠肝組織內可見肝小葉結構模糊,肝索排列紊亂,形態失常,肝竇內多發炎性細胞浸潤,正常的肝組織結構明顯破壞;而上述改變在APAP+MET組小鼠中得到緩解(見圖2)。

2.3 MET對APAP誘導急性肝損傷炎癥因子水平的影響

用ELISA法檢測各組小鼠的TNF-α和IL-6的水平,結果顯示,APAP組TNF-α和IL-6水平均較空白對照組明顯升高,差異均有統計學意義(t分別為27.97,8.25,均P<0.05);相較于APAP組,APAP+MET組TNF-α和IL-6水平明顯下降,差異均有統計學意義(t分別為16.20,11.44,均P<0.05,見圖3)。

與空白對照組比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖1 MET處理對APAP誘導急性肝損傷AST、ALT的影響Figure 1 Effect of MET on AST and ALT levels in APAP-induced acute liver injury mice

圖2 MET處理對APAP誘導急性肝損傷肝組織病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 2 Effect of MET on pathological changes in APAP-induced acute liver injury mice (HE staining,×200)

與空白對照組相比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖3 MET處理對APAP誘導急性肝損傷血清TNF-α和IL-6水平的影響Figure 3 Effect of MET on the serum TNF-α and IL-6 levels in APAP-induced acute liver injury mice

2.4 MET通過減少JNK磷酸化減輕APAP致肝損傷

用Western blot法檢測小鼠肝組織勻漿內p-JNK、JNK的表達,應用β-actin內參校正后,空白對照組、APAP組和APAP+MET組肝組織內JNK含量差異無統計學意義。與空白對照組相比,APAP組肝組織內p-JNK含量明顯增多,差異有統計學意義(t=9.49,P<0.05);而APAP+MET組小鼠肝組織內p-JNK含量較APAP組明顯減少,差異有統計學意義(t=8.79,P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖4 MET對APAP致肝損傷小鼠p-JNK/JNK的影響Figure 4 Effect of MET on the expression of p-JNK/JNK in liver tissue

3 討論

肝臟是藥物在人體中代謝和清除的部位,藥物導致的肝損傷近年來備受關注。APAP作為其中被研究最多的藥物之一,其過量攝入可導致嚴重的肝臟損傷,甚至急性肝衰竭[1]。現有研究結果發現APAP誘導的小鼠急性肝損傷模型中,壞死的肝細胞釋放損傷相關分子模式(damage-associated mole-cular patterns, DAMPs),DAMPs則可被肝內中性粒細胞等識別,并使得這些炎性細胞被激活[10],進一步釋放各種炎性因子如TNF-α和IL-6,從而加重炎癥反應及細胞損傷。炎癥反應被認為是APAP致急性肝損傷的基本機制之一。

MET作為臨床治療2型糖尿病的一線藥物,具有良好的安全性和性價比。MET主要通過抑制肝糖原新生、調節胰島素受體信號等方式調節血糖。臨床研究發現可以通過抑制炎癥反應等方式來減輕急性呼吸窘迫綜合征、腸道缺血再灌注損傷、腦脊髓炎等疾病的組織損傷[11-13]。本研究中,我們嘗試探討MET在APAP誘導肝損傷的潛在作用。實驗發現MET可顯著降低模型小鼠血漿中轉氨酶水平的異常升高并對肝組織病理學損傷有所改善,同時炎癥相關因子TNF-α和IL-6的表達也明顯受抑,以上結果證實MET在APAP肝損傷中具有抗損傷和抗炎作用。

JNK已被證實在多種組織器官(包括肝臟)的損傷、應激、細胞生存與凋亡等方面起著重要調節作用。Gunawan等[14]通過小鼠和體外細胞培養的研究發現在APAP導致的肝損傷中JNK被持續激活,并且發現JNK抑制劑SP600125在體外和體內對APAP肝毒性有顯著的保護作用。Win等[15]研究發現,沉默JNK在線粒體膜上結合位點Sab,可抑制JNK的持續激活和JNK在線粒體膜上定位,對APAP誘導的肝臟損傷起到保護作用。因此MET能否通過抑制JNK的激活對急性肝損傷發揮保護作用值得進一步探討。本研究中,與空白對照組比較,Western blot結果顯示APAP致肝損傷時JNK的磷酸化明顯增多。而MET干預后,p-JNK的表達含量又比APAP組明顯減少,提示MET預處理可減少APAP致肝損傷時JNK的磷酸化。

本研究證實了MET通過抑制JNK的磷酸化對APAP誘導急性肝損傷發揮保護作用。提示二甲雙胍具有治療急性肝損傷的潛在價值,并為其治療提供新的理論依據。但JNK信號調控網相當復雜,更全面的分子機制仍需進一步深入研究。