溫補(bǔ)腎陽方通過ROS/p38 MAPK通路對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株自噬及凋亡的影響

趙志芳,趙志英,楊艷敏,席亞男,劉 泉

(1 邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院血液科,邢臺(tái) 054001;2 北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病科;3 邢臺(tái)市人民醫(yī)院人事科;4 蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科;*通訊作者,E-mail:214834294@qq.com)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一種老年人群常見的惡性血液系統(tǒng)疾病,其發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)[1]。目前,去甲基化藥物和造血干細(xì)胞移植等是MDS治療的主要手段,但治療效果并不十分理想[2]。張新凡等[3]認(rèn)為,脾腎虧虛是MDS發(fā)病的關(guān)鍵所在,給予溫陽補(bǔ)腎方治療后有良好的效果,但溫陽補(bǔ)腎方用于臨床治療MDS的理論依據(jù)還不夠充分。大量研究顯示,細(xì)胞凋亡和自噬異常是MDS發(fā)病的重要機(jī)制[4-6],然而,溫陽補(bǔ)腎方對(duì)MDS細(xì)胞凋亡和自噬的影響并不清楚。因此,本研究以不同濃度的溫陽補(bǔ)腎方含藥血清作用于人MDS細(xì)胞株SKM-1觀察SKM-1細(xì)胞凋亡和自噬的變化,旨在初步探討溫陽補(bǔ)腎方對(duì)SKM-1細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級(jí)SD大鼠購于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心,(190-210)g,合格證號(hào):SCXK(京)-2018-0010。人MDS細(xì)胞株SKM-1、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號(hào):LHY1465、LM-467D;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)的比色檢測(cè)試劑盒購于上海索萊寶生物科技有限公司,貨號(hào):31800-022、S9020、K106-100;噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測(cè)試劑盒和通用總蛋白質(zhì)提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司,貨號(hào):E606334、E606336、C006225;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、Beclin1、P62、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、磷酸化(p)-P38 MAPK抗體購于美國Abcam,貨號(hào):ab8245、ab62557、ab207305、ab62721、ab170099、ab178867。

1.2 溫陽補(bǔ)腎方含藥血清的制備

溫陽補(bǔ)腎方由黃芪(30 g)、黨參(20 g)、熟地(20 g)、山藥(15 g)、白術(shù)(15 g)、山茱萸(15 g)、淫羊藿(15 g)、菟絲子(15 g)、茯苓(15 g)、鎖陽(15 g)、當(dāng)歸(10 g)組成,水煮成每毫升含生藥1 g。根據(jù)人和動(dòng)物服用劑量換算,給予5 g/kg溫陽補(bǔ)腎方藥液灌胃的SD大鼠為低劑量組,給予10 g/kg溫陽補(bǔ)腎方藥液灌胃的SD大鼠為中劑量組,給予20 g/kg溫陽補(bǔ)腎方藥液灌胃的SD大鼠為高劑量組,給予等劑量生理鹽水灌胃的SD大鼠作為生理鹽水組,其中每組10只大鼠,每天早、晚各灌胃1次,持續(xù)7 d。在末次灌胃后2 h內(nèi)腹腔注射10%水合氯醛麻醉取動(dòng)脈血,2 000 r/min離心15 min分離獲得血清;經(jīng)56 ℃滅活處理30 min并以0.22 μm微孔濾膜除菌后,保存于-20 ℃下備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

SKM-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為:空白對(duì)照組(不做任何處理)、生理鹽水組(給予生理鹽水組大鼠血清處理)、藥物低、中、高劑量組(分別給予相應(yīng)劑量大鼠血清處理)。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 MTT法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞增殖活力

以每孔2×104個(gè)細(xì)胞鋪96孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后,按照1.3中的分組處理SKM-1細(xì)胞,另外將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為調(diào)零組;處理24,48,72 h后,根據(jù)MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)各處理組SKM-1細(xì)胞的光密度(optical density,OD)值,并以(實(shí)驗(yàn)組OD-調(diào)零組OD)/(空白對(duì)照組OD-調(diào)零組OD)×100%值表示各組SKM-1細(xì)胞增殖活力。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKM-1細(xì)胞凋亡

以每孔1×105個(gè)細(xì)胞鋪24孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后,根據(jù)1.3中的分組處理各組SKM-1細(xì)胞48 h后收集各組細(xì)胞,參照Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書檢測(cè)各組SKM-1細(xì)胞凋亡率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 比色法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞Caspase-3活性

按照1.3中的分組處理各組SKM-1細(xì)胞48 h后收集各組細(xì)胞,參照Caspase-3的比色檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組SKM-1細(xì)胞Caspase-3活性。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平

以每孔2×105個(gè)細(xì)胞鋪6孔板后,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);SKM-1細(xì)胞貼壁后,根據(jù)1.3進(jìn)行分組處理;處理48 h后,參照ROS檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè),熒光顯微鏡觀察、酶標(biāo)儀檢測(cè)各處理組SKM-1細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)SKM-1細(xì)胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白表達(dá)水平

收集處理48 h的各組SKM-1細(xì)胞,根據(jù)通用總蛋白提取試劑盒說明書提取各組SKM-1細(xì)胞總蛋白后,采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)總蛋白濃度;對(duì)變性蛋白行電泳分離后,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上;經(jīng)封閉處理2 h后,加入Beclin1(1 ∶800)、P62(1 ∶200)、LC3-Ⅰ(1 ∶500)、LC3-Ⅱ(1 ∶500)、P38 MAPK(1 ∶1 000)、p-P38 MAPK(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體室溫孵育2 h;再以二抗(1 ∶2 000)孵育1.5 h后,暗室內(nèi)顯影劑顯影曝光;采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析SKM-1細(xì)胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白表達(dá)水平,其中GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校正。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 溫陽補(bǔ)腎方對(duì)SKM-1細(xì)胞增殖的影響

在相同時(shí)間處理下生理鹽水組和空白對(duì)照組之間SKM-1細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細(xì)胞增殖活力較生理鹽水組明顯降低(P<0.05),且呈一定的藥物濃度依賴性(P<0.05,見表1)。

表1 不同時(shí)間處理下各組SKM-1細(xì)胞的增殖活力

2.2 溫陽補(bǔ)腎方對(duì)SKM-1細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較,生理鹽水組SKM-1細(xì)胞凋亡率以及Caspase-3活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細(xì)胞凋亡率以及Caspase-3活性逐漸升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2和圖1)。

表2 各組間SKM-1細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性的比較

2.3 溫陽補(bǔ)腎方對(duì)SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

與空白對(duì)照組比較,生理鹽水組SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3和圖2)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKM-1細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 1 Flow cytometry analysis of SKM-1 cell apoptosis

2.4 溫陽補(bǔ)腎方對(duì)SKM-1細(xì)胞自噬和P38 MAPK通路的影響

與空白對(duì)照組比較,生理鹽水組SKM-1細(xì)胞中Beclin1、P62蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組SKM-1細(xì)胞中Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值呈濃度依賴性升高,而P62蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3和表4)。

表3 各組SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的比較

圖2 DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平 (×100)Figure 2 ROS level in SKM-1 cells by DCFH-DA fluorescent probe (×100)

圖3 Western blot檢測(cè)SKM-1細(xì)胞中Beclin1、P62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P38 MAPK蛋白表達(dá)Figure 3 Protein expression of Beclin1, P62, LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ and P38 MAPK in SKM-1 cells by Western blot

表4 各組SKM-1細(xì)胞中P62、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-P38 MAPK/P38 MAPK值的比較

3 討論

MDS是一種異質(zhì)性髓系克隆性疾病,起源于造血干細(xì)胞,具有造血功能減低和向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)高的特點(diǎn)[7];雖然去甲基化藥物、傳統(tǒng)化療藥和造血干細(xì)胞移植等使患者生存率有所提高,但因耐藥性和個(gè)體差異等因素導(dǎo)致部分患者的治療效果并不十分理想[8]。MDS在2008年被WHO血液腫瘤分類系統(tǒng)列為髓系腫瘤之一[9],細(xì)胞增殖與凋亡失衡以及自噬活性降低是導(dǎo)致MDS惡性發(fā)展的重要因素[10,11]。Caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶,在細(xì)胞凋亡過程中扮演著執(zhí)行者的角色[12];P62是一種多功能蛋白,在自噬-溶酶體系統(tǒng)蛋白降解過程中發(fā)揮著重要作用[13];Beclin1是一種重要的自噬相關(guān)基因,可通過與相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合體促進(jìn)自噬發(fā)生[14];LC3也是一種自噬相關(guān)基因,可通過酶解變成LC3-Ⅰ,而LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)化為定位于自噬體膜的LC3-Ⅱ,其中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值常用來評(píng)價(jià)自噬水平[15,16]。

中醫(yī)將MDS稱為“髓毒勞”,認(rèn)為“心生血,腎生髓”、“心陽不足,腎陽虧虛”。《醫(yī)宗金鑒》中言“黃芪補(bǔ)表氣”,故溫陽補(bǔ)腎方以黃芪、黨參、熟地為主藥,山藥、山茱萸輔之,加以白術(shù)、茯苓補(bǔ)氣健脾,淫羊藿、菟絲子、鎖陽溫腎填精,另外佐用當(dāng)歸補(bǔ)養(yǎng)營血。全方健脾補(bǔ)腎、益髓填精、益氣生血。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,黃芪的主要化學(xué)成分黃芪多糖可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、影響細(xì)胞生長周期發(fā)揮效用的[17]。黨參多糖能夠有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長和運(yùn)動(dòng)能力,促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡[18]。梁穎等[19]使用熟地黃多糖對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)熟地黃多糖可上調(diào)腫瘤組織中Caspase-3的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究以應(yīng)用最為廣泛的MDS細(xì)胞株SKM-1為研究對(duì)象,給予溫陽補(bǔ)腎方含藥血清作用后發(fā)現(xiàn),SKM-1細(xì)胞增殖活力及P62蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低,而細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈濃度依賴性升高。結(jié)果表明,溫陽補(bǔ)腎方可抑制SKM-1細(xì)胞增殖,上調(diào)Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且通過下調(diào)P62蛋白表達(dá)、上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)以及促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化,從而加速細(xì)胞自噬。

ROS是細(xì)胞內(nèi)氧代謝的副產(chǎn)物,其過量可損壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)生;p38 MAPK是絲氨酸/蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶家族成員,可被ROS活化,在細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等過程中發(fā)揮著重要作用[20-23]。有研究指出,阿糖胞苷可通過上調(diào)ROS水平誘導(dǎo)人MDS細(xì)胞株MUTZ-8的生長并誘導(dǎo)其凋亡[24]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),溫陽補(bǔ)腎方可呈濃度依賴性升高SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平;另外,本研究還發(fā)現(xiàn),溫陽補(bǔ)腎方可呈濃度依賴性上調(diào)P38 MAPK磷酸化水平。結(jié)果表明,溫陽補(bǔ)腎方可促進(jìn)SKM-1細(xì)胞中ROS/P38 MAPK通路活化。提示,溫陽補(bǔ)腎方誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡與自噬的分子機(jī)制可能與其激活ROS/P38 MAPK通路有關(guān)。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)了溫陽補(bǔ)腎方具有抑制SKM-1細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡與自噬的作用,初步揭示了其作用機(jī)制可能與激活ROS/p38 MAPK通路有關(guān)。該結(jié)果為后期進(jìn)一步深入探討ROS/p38 MAPK通路和自噬在溫陽補(bǔ)腎方改善MDS方面的研究奠定了一定基礎(chǔ)。