環(huán)扎法致大鼠脊髓損傷減壓后TGF-β1表達(dá)與凋亡細(xì)胞的相關(guān)性

聶 虎,周乾坤,牛國(guó)旗,楊 民,徐祝軍

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科,蚌埠 233000;2 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院骨科;*通訊作者,E-mail:151810084@qq.com)

在美國(guó)，每年有超過(guò)17 000人遭受脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)，該疾病會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的突然運(yùn)動(dòng)、感覺及自主神經(jīng)損傷，如何有效地促進(jìn)SCI患者神經(jīng)功能的恢復(fù)是當(dāng)前基礎(chǔ)及臨床研究的熱點(diǎn)[1]。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞不可再生，但是現(xiàn)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明：在脊髓損傷早期對(duì)脊柱創(chuàng)傷行手術(shù)固定、脊髓減壓等消除脊柱不穩(wěn)定和椎管狹窄等因素，再在此基礎(chǔ)上行適當(dāng)?shù)乃幬镏委煛⒓?xì)胞移植、基因治療、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等有希望進(jìn)一步促進(jìn)自主神經(jīng)功能的修復(fù)和神經(jīng)細(xì)胞的再生[2-4]。

國(guó)外學(xué)者回顧性研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在正常脊髓組織中幾乎無(wú)明顯表達(dá)，但在SCI后表達(dá)顯著增高，因其具有免疫抑制和炎癥抑制的作用，可抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)展，以減輕神經(jīng)損傷的范圍，可見脊髓損傷后該因子增加是神經(jīng)元的一種自我保護(hù)反應(yīng)。

本研究擬建立一種可形成持續(xù)靜態(tài)壓迫的大鼠脊髓損傷模型，通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓減壓治療，來(lái)觀察脊髓損傷的變化以及神經(jīng)功能恢復(fù)進(jìn)展情況，進(jìn)一步研究TGF-β1的表達(dá)與凋亡細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性，為SCI的修復(fù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

70只雄性SD(Sprague-Dauley)大鼠，平均13周齡，體質(zhì)量169-261 g，平均體質(zhì)量221.2 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為假手術(shù)組10只，僅行胸椎(thoracic vertebra,T)10-11椎板切除，暴露脊髓，不進(jìn)行環(huán)扎。手術(shù)組每組各15只，大鼠胸10-11椎板切除后，環(huán)扎脊髓，用環(huán)扎法使硬膜囊截面壓縮至原截面積的70%，建立脊髓損傷模型，完成此次建模手術(shù)，術(shù)后按照時(shí)間設(shè)定進(jìn)行去除環(huán)扎線的二次手術(shù)分為8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組和不減壓組。減壓組分別環(huán)扎8，24，72 h后二次手術(shù),去除環(huán)扎線減壓；不減壓組環(huán)扎后不進(jìn)行二次手術(shù)減壓。假手術(shù)組和不減壓組只進(jìn)行一次手術(shù)，在術(shù)后1，3，7，14，21 d統(tǒng)計(jì)神經(jīng)功能評(píng)分并處死大鼠取出脊髓。8 h減壓組、24 h減壓組和72 h減壓組進(jìn)行二次手術(shù)后后1，3，7，14，21 d統(tǒng)計(jì)神經(jīng)功能評(píng)分并處死大鼠，取出脊髓。假手術(shù)組各時(shí)間段取材2只大鼠，余各手術(shù)組各時(shí)間段取材3只大鼠，取損傷段脊髓標(biāo)本切片進(jìn)行HE染色，免疫組化(IHC)及TUNEL法檢測(cè)，觀察脊髓損傷后組織病理學(xué)變化，測(cè)定脊髓標(biāo)本損傷段凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)及TGF-β1的表達(dá)變化。

1.2 脊髓損傷模型制備

1.3 大鼠急性脊髓損傷后的護(hù)理

大鼠脊髓急性損傷后常導(dǎo)致截癱，除假手術(shù)組外均表現(xiàn)為雙下肢癱瘓，小便潴留，大便不能控制，大鼠護(hù)理期間注意室溫調(diào)節(jié)，保持15-20 ℃，注意通風(fēng)，勤換水、換墊料，保持鼠籠干燥。術(shù)后注意預(yù)防感染,術(shù)后每日定時(shí)人工按摩膀胱排尿，每日溫肥皂水清洗雙側(cè)下肢及尾巴并保持干燥，防止肢體潰瘍。大鼠取脊髓標(biāo)本前行雙盲法對(duì)每組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)采用BBB評(píng)分(Basso,Beattie,Bresnahan locomotor rating scale)和斜板評(píng)分聯(lián)合使用[8]。

1.4 標(biāo)本制作及圖像分析

對(duì)大鼠評(píng)估神經(jīng)功能評(píng)分后，予乙醚吸入麻醉，經(jīng)胸骨遠(yuǎn)端左緣快速開胸進(jìn)入，小型靜脈留置針準(zhǔn)確插入左心室內(nèi)，生理鹽水灌注后迅速用4%甲醛充分灌注，30 min后暴露損傷脊髓上下段，取環(huán)扎處上下段共1.5 cm脊髓組織，置入4%甲醛中72 h,流水沖洗后進(jìn)行梯度酒精脫水,浸蠟包埋，標(biāo)簽標(biāo)記，冠狀位切片，采用HE染色觀察脊髓組織病理變化,免疫組化測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá),TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞水平。每張切片取光鏡下3個(gè)視野400倍進(jìn)行觀察，采用JEDA 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)采集分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 脊髓標(biāo)本大體組織學(xué)變化

標(biāo)本組織總體可見脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分可見脊髓空洞壞死及陳舊性出血表現(xiàn)。

2.2 HE染色觀察

通過(guò)HE染色脊髓標(biāo)本可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組脊髓組織、細(xì)胞形態(tài)保持完好(見圖1A)；減壓組可見損傷范圍基本恒定，脊髓組織回縮變細(xì)、結(jié)構(gòu)紊亂，出血、髓鞘水腫、斷裂，部分可見脊髓空洞壞死(見圖1B-D)。不減壓組主要表現(xiàn)為空洞性壞死改變以及陳舊性出血表現(xiàn)(見圖1E)。

圖1 各組14 d脊髓取材標(biāo)本HE染色鏡下表現(xiàn) (HE，×400)Figure 1 HE staining of spinal cord samples at day 14 in each group (HE，×400)

2.3 TGF-β1的表達(dá)

每張切片取400倍光鏡下3個(gè)視野進(jìn)行觀察，以細(xì)胞漿和/或核棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。假手術(shù)組未見TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)(見圖2);8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組及不減壓組1 d取材標(biāo)本TGF-β1開始表達(dá)，3 d時(shí)達(dá)到高峰，7 d時(shí)逐漸下降，至21 d仍有表達(dá)(見圖2，表1)，且8 h減壓組、24 h減壓組和72 h減壓組TGF-β1在21 d的表達(dá)普遍低于不減壓組(見表1)。

圖2 各組3 d取材標(biāo)本免疫組化鏡下表現(xiàn) (IHC，×400)Figure 2 Immunohistochemical staining of the samples at day 3 d in each group (IHC，×400)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)脊髓標(biāo)本TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

2.4 細(xì)胞凋亡的變化

每張切片取400倍光鏡下3個(gè)視野進(jìn)行觀察，凋亡細(xì)胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮顆粒深染不規(guī)則，于損傷區(qū)域及周圍彌散性分布，假手術(shù)組基本無(wú)表達(dá)，各手術(shù)組3 d取材標(biāo)本凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(見圖3)。8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組及不減壓組1 d取材標(biāo)本均有不同程度的表達(dá)，3 d達(dá)到高峰，后逐漸下降，21 d仍有表達(dá)(見表2)。72 h減壓組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于8 h減壓組、24 h減壓組，而8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)又遠(yuǎn)低于不減壓組(見表2)。

圖3 各組3 d取材標(biāo)本TUNEL染色 (TUNEL，×400)Figure 3 TUNEL staining of spinal cord tissues at day 3 in each group (TUNEL，×400)

表2 各組時(shí)間點(diǎn)切片凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.5 TGF-β1的表達(dá)與凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析

收集TGF-β1及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用線性相關(guān)分析。各減壓組TGF-β1及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)分析顯示：相關(guān)系數(shù)r=0.915-0.958，雙側(cè)Pearson檢驗(yàn)P=0.010-0.029，在0.05水平(雙側(cè))顯著相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。可見，TGF-β1計(jì)數(shù)與凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)呈線性相關(guān)。

2.6 各組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能BBB評(píng)分及斜板評(píng)分

假手術(shù)組BBB及斜板評(píng)分大致接近正常，近似呈水平線。8 h減壓組和24 h減壓組BBB及斜板評(píng)分自術(shù)后1 d呈逐漸上升趨勢(shì)，兩者評(píng)分基本相似，無(wú)明顯差異；72 h減壓組各時(shí)間點(diǎn)BBB及斜板評(píng)分均較8 h減壓組、24 h減壓組組低。不減壓組評(píng)分最低，且恢復(fù)趨勢(shì)不明顯，神經(jīng)功能恢復(fù)差(見圖5，6)。各組BBB及斜板評(píng)分組間行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 8 h減壓組與24 h減壓組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各組兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BBB及斜板評(píng)分8 h減壓組、24 h減壓組>72 h減壓組>不減壓組，可見減壓后大鼠功能評(píng)分隨著時(shí)間的推移，BBB及斜板評(píng)分呈逐漸上升的趨勢(shì)，且評(píng)分優(yōu)于不減壓組大鼠功能評(píng)分。

圖4 各組TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的線性相關(guān)圖Figure 4 Linear correlation of TGF-β1 positive cells with apoptotic cell counts in each group

與假手術(shù)組比較，aP <0.05；與8 h減壓組比較，bP <0.05；與24 h減壓組相比，cP <0.05；與72 h減壓組相比，dP <0.05圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分Figure 5 BBB score at different time points in each group

與假手術(shù)組比較，aP <0.05；與8 h減壓組比較，bP <0.05；與24 h減壓組相比，cP <0.05；與72 h減壓組相比，dP <0.05圖6 各組不同時(shí)間點(diǎn)斜板評(píng)分Figure 6 Inclined board score at different time points in each group

3 討論

獲得理想的脊髓損傷動(dòng)物模型是研究SCI損傷機(jī)制、探索神經(jīng)修復(fù)過(guò)程、提高醫(yī)治效果并將之應(yīng)用于臨床的首要前提。回顧以往文獻(xiàn)，近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道了多種不同方法建立的脊髓損傷模型，造模的方法種類甚多，但各種造模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)需要及臨床SCI的損傷特點(diǎn)，對(duì)Richard等[9]報(bào)道的用帶狀物環(huán)繞犬圓錐并結(jié)扎，以制作硬膜囊受壓動(dòng)物模型的方法進(jìn)行了改進(jìn)，使之用于更易護(hù)理的嚙齒類動(dòng)物。環(huán)扎法較之以上所述方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：可一次性完成脊髓損傷及靜態(tài)持續(xù)受壓，術(shù)中無(wú)需特殊器械及儀器，方法簡(jiǎn)便易行，可重復(fù)操作性好。另外環(huán)扎法建立的脊髓靜態(tài)持續(xù)壓迫模型，與臨床上脊柱骨折產(chǎn)生壓迫致脊髓損傷的特點(diǎn)具有一定的相關(guān)性，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床的特點(diǎn)。

脊髓損傷后，不同減壓時(shí)間點(diǎn)療效是進(jìn)行手術(shù)時(shí)機(jī)選擇的重要依據(jù)；神經(jīng)功能的評(píng)價(jià)是對(duì)模型術(shù)后功能恢復(fù)具有客觀意義的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用兩種評(píng)分相結(jié)合的方式，避免了單一評(píng)價(jià)方式的不足，在評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能水平的同時(shí)也間接評(píng)價(jià)了大鼠后肢肌力的恢復(fù)水平，增加了實(shí)驗(yàn)評(píng)分的準(zhǔn)確性和可靠性[10]。SCI要求積極早期減壓[11,12]，但結(jié)合實(shí)際情況，如就診、轉(zhuǎn)診時(shí)間、復(fù)合傷病情等，故8，24，72 h減壓是黃金時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)中細(xì)分這幾個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于手術(shù)時(shí)機(jī)把握及獲得最佳的遠(yuǎn)期療效，具有重要意義。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠術(shù)后BBB評(píng)分及斜板評(píng)分未見明顯異常，總體評(píng)分基本接近于正常水平。8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組大鼠評(píng)分情況較不減壓組差異明顯，8 h減壓組、24 h減壓組、72 h減壓組大鼠不同時(shí)間減壓后評(píng)分均逐漸提高，神經(jīng)功能逐步好轉(zhuǎn)，且8 h減壓組、24 h減壓組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分較72 h減壓組差異明顯，不減壓組大鼠評(píng)分顯示大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)緩慢，后肢肌力及運(yùn)動(dòng)能力未得到明顯改善。

在本組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)大鼠脊髓標(biāo)本進(jìn)行HE染色、免疫組化及TUNEL法檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠脊髓標(biāo)本損傷狀況以及統(tǒng)計(jì)TGF-β1和凋亡細(xì)胞的表達(dá)。在標(biāo)本檢測(cè)中，手術(shù)組TGF-β1和凋亡細(xì)胞的表達(dá)基本表現(xiàn)為先增高后逐步降低的趨勢(shì)。其中不減壓組最為明顯，高度表達(dá)。回顧國(guó)外學(xué)者研究文獻(xiàn)[3-5]，TGF-β1廣泛存在于人血小板和哺乳動(dòng)物骨骼中，是一類廣泛存在的多肽類生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)作用，主要參與組織創(chuàng)傷修復(fù)、胚胎發(fā)育、免疫、炎癥、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積等密切相關(guān)的多功能的細(xì)胞因子。近來(lái)研究表明[13,14]：TGF-β1與急性脊髓損傷的修復(fù)關(guān)系密切，在脊髓損傷后表達(dá)增加，可能與其具有免疫抑制、炎癥抑制的作用相關(guān)，是機(jī)體對(duì)神經(jīng)損傷的一種自我保護(hù)反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子鞘內(nèi)給藥處理急性大鼠脊髓損傷，可以明顯減輕脊髓損傷的范圍，推斷TGF-β1通過(guò)抑制膠質(zhì)瘢痕形成來(lái)為脊髓損傷修復(fù)提供良好的環(huán)境[15]。Yuan等[16]實(shí)驗(yàn)表明：大鼠脊髓損傷后TGF-β1、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κb等促炎因子增加，通過(guò)抗炎作用降低細(xì)胞內(nèi)成分膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)；抑制反應(yīng)性膠質(zhì)增生。另外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子還具有神經(jīng)元保護(hù)作用的功能，能夠促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元的存活，可以促血管形成及促進(jìn)軸突的伸長(zhǎng)[17]。Sulaiman等[18]研究也證實(shí)，在大鼠脛神經(jīng)損傷模型中，局部使用TGF-β1對(duì)神經(jīng)元再生有顯著效果，證實(shí)TGF-β1能抑制T細(xì)胞的增生和小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性分子和炎癥前因子的釋放，減少炎癥引起的組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)元的損傷修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，隨著脊髓減壓時(shí)間的推遲，72 h減壓組大鼠減壓后神經(jīng)功能恢復(fù)水平如BBB評(píng)分及斜板評(píng)分較早期減壓組(8 h減壓組和24 h減壓組)有明顯差異，且TGF-β1的表達(dá)也較高。而不減壓組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分更低，且TGF-β1的表達(dá)水平較手術(shù)減壓組也較高，基本符合以往文獻(xiàn)報(bào)道[13，16]，可以證實(shí)TGF-β1對(duì)脊髓損傷的修復(fù)有一定的促進(jìn)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，隨著脊髓減壓時(shí)間的推遲，72 h減壓組大鼠減壓后神經(jīng)功能恢復(fù)水平如BBB評(píng)分及斜板評(píng)分較早期減壓組(8 h減壓組和24 h減壓組)有明顯差異，且凋亡細(xì)胞水平也較早期減壓組高，TGF-β1的表達(dá)也相應(yīng)較高。同時(shí)，在不減壓組與減壓組的比較中，可見不減壓組相同時(shí)期內(nèi)凋亡細(xì)胞水平和TGF-β1的表達(dá)、BBB評(píng)分、斜板評(píng)分均顯著高于減壓組。

在凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)與TGF-β1表達(dá)的計(jì)數(shù)對(duì)比中可見：正常脊髓中不表達(dá)凋亡細(xì)胞和TGF-β1，發(fā)生SCI后，機(jī)體啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡程序，同時(shí)在脊髓損傷后也立即出現(xiàn)了TGF-β1的表達(dá)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，證實(shí)：各組不同時(shí)間減壓后，凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)與TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)存在相關(guān)性，且經(jīng)方差分析后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)在減壓術(shù)后3 d達(dá)高峰，后逐漸下降，并持續(xù)表達(dá)。TGF-β1在3 d達(dá)高峰后逐漸下降，并持續(xù)表達(dá)。在早期減壓中，凋亡細(xì)胞的峰值水平遠(yuǎn)低于晚期減壓組及不減壓組，與Park等[19]的報(bào)道結(jié)果相符合。對(duì)比TGF-β1與凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)可見：隨著TGF-β1表達(dá)的增加，凋亡細(xì)胞呈進(jìn)行性下降。故推測(cè)，在脊髓損傷凋亡啟動(dòng)后，脊髓損傷處高度表達(dá)的TGF-β1可能對(duì)凋亡有阻斷作用，從而限制凋亡的進(jìn)一步發(fā)展，以保護(hù)周圍神經(jīng)元，以此來(lái)減輕脊髓損傷的范圍。

綜上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明，脊髓損傷大鼠早期(24 h內(nèi))有效的脊髓減壓對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)起著至關(guān)重要的作用，神經(jīng)功能評(píng)分(斜板評(píng)分及BBB評(píng)分)明顯優(yōu)于72 h減壓組及不減壓組。且對(duì)比TGF-β1與凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)可見：隨著TGF-β1表達(dá)的增加，凋亡細(xì)胞呈進(jìn)行性下降，推測(cè)TGF-β1可抑制凋亡的進(jìn)一步發(fā)展，并且具有神經(jīng)元保護(hù)功能。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道局部干細(xì)胞移植可有效促進(jìn)神經(jīng)元的再生[20]，預(yù)計(jì)可能在不久的將來(lái)，應(yīng)用3D打印技術(shù)，移植膠原蛋白/殼聚糖支架來(lái)改善神經(jīng)損傷后軸突再生將是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。