長鏈非編碼RNA uc.412在腎臟纖維化中的表達及作用

文先麗，李善文，趙雅潔，黃嬋，朱仙藝，甘衛華，張愛青

(南京醫科大學第二附屬醫院兒科，南京 210003)

慢性腎臟病在世界范圍內的發病率較高，且病情隱匿，易合并多種并發癥。慢性腎臟病的病因復雜多樣，但腎臟纖維化是慢性腎臟病晚期的共同特征和關鍵改變，也是慢性腎臟病發展至終末期腎病的共同病理改變[1-2]。腎臟纖維化的主要病理改變包括腎固有細胞轉分化為肌成纖維細胞導致的腎小球硬化、細胞外基質大量沉積于間質導致的腎間質內纖維化以及腎內血管硬化，纖維化改變最終導致腎臟組織損傷和功能衰竭[3]。系膜細胞作為腎固有細胞的一種，在腎臟纖維化中發生表型轉化，伴有增殖及細胞外基質增多改變，還可通過分泌效應擴大細胞因子損傷腎小球，引起腎小球硬化進而導致腎臟纖維化[4-6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在生物細胞中廣泛存在，參與多種生物學過程，如影響基因轉錄、調控基因表達、參與細胞間通訊和重組、改變細胞運動能力等[7]。本課題組在前期研究中通過高通量測序及生物信息學分析發現，LncRNA uc.412的表達水平可能與腎臟纖維化相關，通過對UCSC數據庫進行分析發現LncRNA uc.412序列在人類、大鼠和小鼠基因組的同源區之間高度保守[8]。本研究擬通過建立經典單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)的小鼠腎臟纖維化模型和體外系膜細胞損傷模型，檢測LncRNA uc.412與腎臟纖維化相關基因的表達，進一步探究LncRNA uc.412在腎臟纖維化中的作用，為后續LncRNA的作用機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物和細胞 12只SPF級雄性C57BL/6小鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司[生產許可證：SCXK(蘇)2016-0010；使用許可證：SYXK(蘇)2016-0014)]，周齡6～8周，體重16.9～22.8 g，小鼠在東南大學SPF級動物實驗室飼養。動物實驗符合醫學動物倫理要求。大鼠腎小球系膜細胞購自美國Type Culture Collection(ATCC)公司。

1.1.2主要試劑和材料 血清肌酐、尿素氮檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Trizol購自美國ThermoFisher Scientific公司(批號：LOT:262306)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物購自上海銳真生物科技有限公司，PCR試劑購自日本TAKARA公司(批號：AJ60587A)，動物蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、β-肌動蛋白(β-Actin)以及Ⅰ型膠原蛋白(collagen 1，COL1)蛋白抗體購自英國Abcam公司，LncRNA uc.412的siRNA購自上海吉馬制藥技術有限公司，SIS3購自美國MedChemExpress(MCE)公司(批號：HY-13013)。

1.2實驗方法

1.2.1UUO模型建模方法 小鼠先于動物實驗中心內適應性喂養7 d，然后隨機分為對照組和UUO組，各6只。手術方法：將1%戊巴比妥鈉溶液以20 mg/kg的濃度對小鼠進行腹膜內麻醉。UUO組小鼠左側輸尿管結扎于左腎的腎門附近；對照組小鼠僅行左輸尿管鈍性分離，但不行結扎術，隨后關閉腹腔。術后兩組小鼠均正常喂養。在手術后第14天以頸椎脫臼法處死小鼠。收集小鼠的血液1.5 mL，以離心半徑13.5 cm，3 000 r/min離心5 min，收集上層血清并于-80 ℃保存。分離小鼠左腎組織，貼壁儲存于1.5 mL EP管中并于-80 ℃保存，用于后續研究。

1.2.2血清肌酐和尿素氮水平檢測 采用蒸餾水以1∶200的比例稀釋血樣后，取1.6 mL置于離心管中作為測量管，并設空白管(加1.6 mL蒸餾水)1管和標準管1管。每管分別加入0.5 mL苦味酸溶液和0.5 mL氫氧化鈉溶液；充分混合后置于37 ℃中水浴10 min，冷卻后調零，于510 nm處測量每個管的吸光度，計算血肌酐值。取0.02 mL血清置于離心管中，并設空白管和標準管。每管加入1 mL鄰苯二甲酸二乙酯脂溶液和1 mL氯化鐵-磷酸溶液，混合后水浴15 min，冷卻后調零，并測量520 nm處的吸光度，計算血尿素氮值。

1.2.3Masson染色檢測腎臟組織標本纖維化程度 將包埋小鼠腎臟組織的石蠟切片常規脫蠟至水，依次用Regaud蘇木精染料染核，使胞核呈藍褐色，麗春紅酸性品紅染色，使胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，苯胺藍溶液復染，使膠原纖維呈藍色，可區分膠原纖維和肌纖維，光學顯微鏡下觀察組織纖維化程度。

1.2.4大鼠系膜細胞培養 大鼠系膜細胞快速復蘇后用含10%胎牛血清的杜爾貝科改良培養基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液，0.25%胰酶消化傳代。待細胞生長至對數生長期時，更換無血清培養基DMEM對細胞進行同步化處理12 h。用轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(10 μg/L)和siRNA(75 nmol/L)干預分組：對照組、TGF-β1組、siRNA組、TGF-β1+siRNA組；用TGF-β1(10 μg/L)和SIS3(1 μmol/L)干預分組：對照組、TGF-β1組、SIS3組、TGF-β1+SIS3組。

1.2.5siRNA轉染大鼠系膜細胞 LncRNA uc.412的siRNA由上海吉馬生物科技有限公司設計合成，LncRNA uc.412 siRNA(5′-GCCGGCCAUACAGUUG-AUUTT-3′)，反義鏈序列為(5′-AAUCAACUGUAUGGCCGGCTT-3′)。將系膜細胞接種至12孔板培養孔中，使轉染時細胞密度達50%～70%，參考上海吉馬生物科技有限公司的siRNA說明書操作：用無菌水稀釋siRNA至20 μmol/L；參考美國Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉染說明書操作：用無血清培養基稀釋siRNA分別至濃度25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L，取4 μL LipofectamineTM2000稀釋于100 μL培養基中，室溫孵育5 min，將上述溶液混合后室溫靜置20 min。以10 μg/L TGF-β1干預細胞，按照不同分組處理細胞：對照組(Lipo2000)、TGF-β1組(TGF-β1+Lipo2000)、TGF-β1+25 nmol/L siRNA組(TGF-β1+Lipo2000+25 nmol/L siRNA)、TGF-β1+50 nmol/L siRNA(TGF-β1+Lipo2000+50 nmol/L siRNA)組、TGF-β1+75 nmol/L siRNA組(TGF-β1+Lipo2000+75 nmol/L siRNA)。

1.2.6RNA的提取及實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)法檢測mRNA和LncRNA表達量 每50～100毫克腎臟組織加入1 mL Trizol(六孔板內細胞每孔加1 mL)，將混合物靜置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動15 s后冰浴10 min。在4 ℃，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min，集上清至新離心管并測量其體積。加入等量異丙醇，輕柔混合，常溫靜置10 min，4 ℃，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，棄上清。加1 mL 75%乙醇溶液渦旋震蕩以清洗沉淀。4 ℃，離心半徑10 cm，7 500 r/min離心5 min，棄上清，重復1次。短時間內干燥，加20 μL DEPC水溶解RNA，并在260 nm處測量吸光度以定量RNA濃度。據日本TAKARA公司要求嚴格制備cDNA。完成后以cDNA為樣本配置總量為10 μL的PCR反應體系，用LightCycler 96的PCR儀(ROCHE集團)檢測結果。實驗重復3次，根據內參表達量檢測計算目標基因的相對表達，相對表達量通過2-ΔΔCT法算，使用的引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.7總蛋白的提取及蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測目的蛋白表達量 使用Western blot法檢測目的蛋白的表達，取樣本(小鼠腎組織30 mg或細胞皿內細胞)加入適量的組織蛋白裂解液后研磨，冰上裂解10 min，4 ℃，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，收集上清至新離心管，蛋白定量BCA法試劑盒測定總蛋白濃度，標化濃度后將其置于100 ℃金屬加熱器中煮沸5 min還原，然后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜成功后將膜完全浸入5%牛血清白蛋白中，室溫下封閉1 h，4 ℃，一抗溶液中孵育14～16 h，TBS+Tween洗滌緩沖液漂洗3次，加入二抗抗體中，室溫下孵育1 h，TBS+Tween洗滌緩沖液漂洗3次，計算曝光處理后蛋白表達水平，檢測目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

2 結 果

2.1兩組小鼠血生化指標和腎臟纖維化改變的比較 UUO組小鼠血肌酐和血尿素氮水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。Masson染色結果顯示：對照組腎臟的形態結構基本正常；UUO組結扎側腎臟表現為腎小管嚴重萎縮，UUO組腎臟組織膠原纖維染色區域(藍色)面積較對照組明顯增大。見圖1。

表2 兩組小鼠血生化指標比較

UUO:單側輸尿管結扎；1a：對照組；1b:UUO組

2.2兩組小鼠腎組織LncRNA uc.412、α-SMA、TGF-β1、COL1基因水平比較 UUO組LncRNA uc.412、α-SMA、TGF-β1、COL1 mRNA的表達高于對照相(P<0.05)，見表3。

表3 兩組小鼠腎組織LncRNA uc.412、α-SMA、TGF-β1、COL1基因水平比較

2.3兩組小鼠腎組織COL1蛋白表達的比較 UUO組小鼠腎組織的COL1蛋白表達量高于對照組(2.629±0.045比0.969±0.003)(t=51.520，P<0.001)。見圖2。

UUO：單側輸尿管結扎；β-Actin：β-肌動蛋白；COL1：Ⅰ型膠原蛋白

2.4siRNA對TGF-β1誘導大鼠系膜細胞α-SMA蛋白表達的影響 各組LncRNA uc.412基因表達比較差異有統計學意義(P<0.01)，TGF-β1組LncRNA uc.412的表達量高于對照組，其他組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+25 nmol/L siRNA組、TGF-β1+50 nmol/L siRNA組、TGF-β1+75 nmol/L siRNA組LncRNA uc.412的表達量低于TGF-β1組(P<0.05)，TGF-β1+25 nmol/L siRNA組、TGF-β1+50 nmol/L siRNA組、TGF-β1+75 nmol/L siRNA組間兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)，其中TGF-β1+75 nmol/L siRNA組LncRNA uc.412的表達量減少最明顯，選擇該濃度siRNA進行后續實驗，見表4。

表4 siRNA干預大鼠腎臟系膜細胞后LncRNA uc.412基因的表達 (n=3)

各組α-SMA蛋白表達比較差異有統計學意義(P<0.01)，TGF-β1組高于對照組，其他組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+siRNA組低于TGF-β1組(P<0.05)，siRNA組與TGF-β1比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+siRNA組與siRNA組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、圖3。

表5 siRNA干預大鼠腎臟系膜細胞后α-SMA蛋白的表達 (n=3)

TGF-β1：轉化生長因子-β1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；COL1：Ⅰ型膠原蛋白；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白

2.5SIS3對大鼠腎臟系膜細胞LncRNA uc.412表達的影響 各組LncRNA uc.412表達比較差異有統計學意義(P<0.01)，TGF-β1組高于對照組，SIS3組、TGF-β1+SIS3組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+SIS3組低于TGF-β1組，SIS3組與TGF-β1組比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+SIS3組與SIS3組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 SIS3干預大鼠腎臟系膜細胞后LncRNA uc.412基因的表達 (n=3)

3 討 論

近年來研究發現，LncRNA通常具有復雜的二級和三級結構以及多樣的亞細胞定位。LncRNA參與RNA加工[9]、基因轉錄調控[10]、染色質修飾[11]、細胞凋亡、端粒維持等功能，并在生物學過程中發揮重要作用。有研究顯示，LncRNA與腎臟纖維化及慢性腎臟病的發生發展密切相關。Han等[12]發現在局灶節段性腎小球硬化中LncRNA LOC105375913表達水平顯著升高，可通過與miR-27b結合持續地過表達Snail而發揮促纖維化功能。Wang等[13]發現LncRNA生長抑制特異性轉錄本5可通過競爭性結合miR-96-5p導致腎纖維化過程。Xue等[14]發現LncRNA母系表達基因3通過miR-185/DNA甲基轉移酶1/母系表達基因3通路的調節作用，抑制TGF-β1誘導的腎纖維化過程。

本研究選取UUO這一經典纖維化模型，通過Masson染色、生化指標檢測得出UUO組小鼠肌酐、尿素氮水平高于對照組，UUO組腎臟組織膠原纖維染色區域面積較對照組明顯增大，從而驗證模型成功，后用該模型腎臟標本進行qPCR檢測UUO組LncRNA uc.412以及COL1、α-SMA、TGF-β1的表達水平，結果顯示LncRNA uc.412在UUO模型中表達水平顯著升高，與纖維化指標COL1表達量改變一致，與纖維化重要影響因子TGF-β1表達量改變一致，提示LncRNA uc.412可能參與UUO模型腎臟纖維化的發生。為了探究UUO模型中LncRNA的表達變化與TGF-β1變化的相關性，本研究進一步行體外實驗，在大鼠系膜細胞中用TGF-β1和LncRNA uc.412的siRNA干預細胞，結果顯示TGF-β1可使系膜細胞內纖維化相關蛋白α-SMA的表達量上調，而這種改變可被LncRNA uc.412的siRNA所抑制，提示TGF-β1可通過上調LncRNA uc.412的表達而誘導系膜細胞纖維化改變。

TGF-β1是在纖維化中已得到公認的關鍵細胞因子之一[15]，在纖維化的發生發展及治療中起重要作用[16]。在TGF-β1/Smad信號通路中，TGF-β1活化后可直接結合TGF-β受體Ⅱ，激活的TGF-β受體Ⅱ進一步募集TGF-β受體 Ⅰ，進而導致Smad2和Smad3的磷酸化，然后已活化的Smad2/3與Smad4結合，使整個復合物轉移到細胞核中以此來增加纖維粘連蛋白、α-SMA、膠原蛋白基因的轉錄[17]。SIS3具有強效、高選擇性抑制Smad3的功能。SIS3可抑制TGF-β1誘導的磷酸化Smad3、Smad3與Smad4相互作用以及Smad3與細胞核DNA結合，且不影響Smad2磷酸化。同時SIS3可減弱TGF-β1轉錄活性，抑制TGF-β1誘導成肌纖維細胞轉化為成纖維細胞[18]。Li等[19]通過實驗證明，Smad3磷酸化抑制劑SIS3可通過減少內皮-間充質轉化減輕糖尿病腎病的纖維化水平，而在LncRNA領域也有研究證明LncRNA-TSI[20]、LncRNA Erbb4-IR(np_5318)[21]等可通過調控TGF-β1/Smad通路來影響腎纖維化的過程。本研究在大鼠系膜細胞中進行TGF-β1和Smad3特異性抑制劑SIS3干預處理，結果顯示TGF-β1可刺激LncRNA uc.412的表達上調，而這種改變可被SIS3所抑制，提示TGF-β可能是通過TGF-β1/Smad3信號通路上調LncRNA uc.412的表達。結合動物實驗及TGF-β1/Smad信號通路相關細胞實驗研究結果推測，在UUO模型中表達增高的TGF-β可能通過TGF-β1/Smad3信號通路增加腎臟LncRNA uc.412的表達，促進腎臟纖維化的發生。

綜上所述，LncRNA uc.412可能與慢性腎臟病腎臟纖維化的發生發展密切相關，且可能與TGF-β/Smad3信號通路有關，而LncRNA uc.412發揮作用的具體方式及其下游的作用因子有待進一步研究。