脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點的篩選及其特征分析

朱佶軒，戴 琴，段健誠，高 娜，高 威，閻斌倫,2，高 煥,2,3

( 1.江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇省海洋生物資源與生態環境重點實驗室， 江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005； 3.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014 )

單核苷酸多態性(SNP)指不同個體間基因組上同一位點上的單核苷酸序列存在差異，這種多態性位點具有密度高、遺傳穩定、代表性強、易實現自動化分析等優點[1]，因此成為第三代分子標記的典型代表，在親緣鑒定、分子標記、遺傳育種和疾病防控等領域有著廣泛的應用[2-3]。線粒體基因組具有母性遺傳的特點，因此其上的分子標記，尤其是SNP標記，已經成為親緣鑒定[4]、遺傳多樣性分析[5]的重要工具。目前該技術在經濟甲殼動物的研究中應用廣泛，如對斑節對蝦(Penaeusmonodon)的PmCatL、PmTry以及PmAmy基因進行檢測后發現了56個能夠控制生長性狀的SNP位點[6]；Zhang等[7]在合浦絨螯蟹(Eriocheirhepuensis)和中華絨螯蟹(E.sinensis)中找到的能夠穩定遺傳的SNP位點，開發出了DNA條形碼。

SNP的檢測技術經歷過許多的探索和改進，從限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)、單鏈構象多態性法(PCR-SSCP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等以凝膠電泳為基礎的傳統方法到近年來發展運用的DNA測序法、DNA芯片檢測、變性高效液相色譜法(DHPLC)、高分辨率熔解曲線(HRM)等技術，對SNP的檢測越發注重于自動化和高通量[8]。高分辨率熔解曲線技術可以通過實時監測不同個體熔解曲線的形狀和位置上的差異檢測出序列變化，與其他技術相比，具有低成本、易操作、高通量、高靈敏度等優勢，適合用于對未知SNP位點的篩查和分析。

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國特有的養殖蝦類，具有繁殖能力強、生長速度快、環境適應性強等特點，是開展甲殼動物生物學研究的良好生物材料，加之脊尾白蝦具有重要的養殖經濟價值[9]，很多甲殼類研究者都傾向于將其當作海水甲殼類物種研究的模式生物使用[10]，近年來不僅在養殖技術[11]、養殖模式[12]等方面受到諸多關注，在遺傳學研究方面也受到了廣泛的關注，如利用微衛星對脊尾白蝦野生群體和近交群體的遺傳多樣性進行分析[13-14]。作為一個潛在的甲殼類研究模式物種，它在很多方面的遺傳信息還有待進一步挖掘，如其線粒體基因組中的SNP位點還不清楚，這一定程度上限制了該蝦在家系識別、遺傳多樣性分析，甚至進化生物學方面的研究。筆者希望通過利用高分辨率熔解曲線技術對脊尾白蝦線粒體全基因組(mtDNA)中的SNP位點進行篩查，為進一步開展該蝦的遺傳育種、家系鑒定等工作提供理論基礎[15-16]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的脊尾白蝦為實驗室分3個時間段在連云港沿海地區(柘汪鎮、海頭鎮和青口鎮)的養殖池塘和南通呂四港附近(1次)采集獲得的樣本，每次采集樣本30～100尾，并在每個批次中選取6～10尾組成本試驗的樣本群體，以實現樣本遺傳背景來源的多樣化。試驗前將采集樣本置于循環水養殖系統內暫養7 d，暫養期間連續充氣，每日早晚各投餌1次，投餌0.5 h后清污[17]。

1.2 樣品DNA的提取

從30～50尾備選群體中選取健康活躍、大小合適的成年脊尾白蝦30尾(編號為1～30)，體長(5.23±0.33) cm、體質量(0.91±0.19) g。取其新鮮肌肉組織，液氮研磨后用生工生物工程(上海)股份有限公司生產的動物基因組DNA快速抽提試劑盒來提取脊尾白蝦總基因組DNA，經GeneQuant Pro測定基因組DNA樣品質量濃度后，均一化為20 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.3 引物設計及篩選優化

1.3.1 引物的設計與驗證

根據美國國立生物技術信息中心數據庫中得到的脊尾白蝦線粒體全基因組序列(EF560650.1)，利用Primer Premier 5.0(Premier biosoft international, USA)通過步移法設計出覆蓋mtDNA全長的引物，其產物擴增長度為100～150 bp[18]。本次試驗共設計出109對引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按說明書要求稀釋后進行PCR擴增，反應體系總體積為10 μL：ddH2O 7.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.6 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.2 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA(20 ng/μL)0.2 μL。用Touch-down PCR程序進行驗證：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，其中退火溫度每循環降低1 ℃，共15個循環；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物，排除未得到目的條帶的引物。

1.3.2 引物優化

為防止引物二聚體對后續高分辨率熔解曲線檢測產生影響，對初篩引物進行溫度梯度優化，確定其最佳退火溫度。PCR反應體系總體積為10 μL(成分比例同1.3.1)，用溫度梯度PCR程序進行優化：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證并對比，確定引物的最佳退火溫度。

1.4 高分辨率熔解曲線檢測

對提取的30尾脊尾白蝦DNA樣品進行分組混樣，以10尾為1組，共分為3組混合DNA樣品，編號分別為H1(1～10)、H2(11～20)、H3(21～30)[19]。本試驗首先在混合DNA中進行第1次高分辨率熔解曲線檢測，將存在差異峰的引物在對應混合DNA的單個體樣品DNA中進行第2次高分辨率熔解曲線檢測，從而確定存在突變的單個體DNA樣品。

1.4.1 PCR擴增

PCR反應體系總體積為35 μL：ddH2O 24.5 μL，10×PCR Buffer 3.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.1 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.7 μL，Taq DNA聚合酶 0.7 μL，上下游引物各1.4 μL，混合DNA模板(20 ng/μL)0.7 μL。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，相應溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.2 高低溫內標合成

高低溫內標分別為：5′-GCGGTCAGTCGGC CTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGAC GCTCAG-3′、5′-ATCGTGATTTCTATAGTTAT CTAAGTAGTTGGCATTAATTTCATTTT-3′及各自的反向互補序列，且3′端進行磷酸化封閉，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[18]。反應體系為：飽和NaCl 1.0 μL，正反引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，共10 μL的體系。放入PCR儀，95 ℃反應3 min，4 ℃保存。程序結束后，將高低溫內標等比混合彈勻備用。

1.4.3 高分辨率熔解曲線檢測

在每管PCR擴增產物中加入7 μL高低溫內標混合溶液，混合均勻后放入PCR儀，95 ℃變性3 min，25 ℃復性2 min，4 ℃保存。吸取10 μL PCR擴增產物加到96孔板中，每組3個平行。再加入1 μL LC Green染料及25 μL礦物油，放入微孔板離心機中短暫離心，利用LightScanner 96系統進行檢測，分析所得溶解曲線，判斷同一引物在不同個體間是否發生差異，記錄存在差異峰的引物及其對應的個體數。

1.4.4 序列測序分析

將高分辨率熔解曲線檢測出的每個差異峰所對應的擴增樣品(3～5個)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，經過對比分析后統計脊尾白蝦線粒體基因組中SNP位點的數目、類型及位置。

2 結 果

2.1 引物篩選及優化結果

根據脊尾白蝦mtDNA序列設計出的109對引物中，有29對未出現擴增產物，對剩下的80對引物進行溫度梯度PCR優化，確定其最佳退火溫度。

根據最佳退火溫度，將80對篩選后的引物分別在H1、H2、H3 3組混合DNA樣品中進行高分辨率熔解曲線檢測。檢測分析發現，共有13對引物在3組混合DNA樣品中出現了不同的熔解曲線和熔解峰。進一步將存在差異峰的引物在其對應的混合DNA組中分別進行單個體DNA樣本的擴增及高分辨率熔解曲線檢測，分析出現差異的單個DNA樣品。同一引物擴增片段在不同DNA個體間出現了顯著的差異峰(圖1)，由此可以判斷這一段序列在不同個體之間存在差異性，可能發生了堿基突變現象。

2.2 SNP分析

經序列比較表明，在上述13對引物擴增序列中有9對引物的擴增序列中含有SNP突變位點(表1)。

圖1 同一引物在不同單個體(a)和(b)中的熔解曲線Fig.1 The melting curves of the same primer in different individuals (a) and (b) 4和H1為同一引物在混合DNA H1中的4號單個體和其他單個體中檢測出的熔解曲線，曲線的差異說明它們之間存在SNP突變位點. 4 and H1 are the melting curves of the same primers detected in the single DNA No. 4 and other single bodies in the mixed DNA H1; the difference in the curves indicates that there are SNP mutation sites between them.

表1 脊尾白蝦線粒體基因組SNP引物

在這9對引物的擴增序列中，共篩查到16個SNP突變位點，在脊尾白蝦線粒體全基因組上的分布頻率為0.10/100 bp。其中包括14個轉換突變(C/T和G/A)，2個顛換突變(A/T)，轉換和顛換突變形式的比率為87.5%和12.5%。進一步將檢測得到的16個SNP位點與公布的脊尾白蝦mtDNA序列進行定位分析，發現所得SNP位點主要分布在脊尾白蝦mtDNA的COX1、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob 7個區域，其中COX1基因區域的SNP位點數量最多，共有5個，占總SNP位點的26.7%，其次為cob的突變位點數目為3個，占所得總突變量的20%，在COX2、tRNAAsp及nad1、nad4、nad5等區域各發現1～2個SNP位點(表2)。進一步比對所得SNP位點突變前后對應密碼子所編碼的氨基酸種類變化，統計SNP位點的突變類型和比例。結果顯示，16個SNP位點均位于蛋白基因編碼區，其中不改變氨基酸種類的同義SNP位點有7個，占已獲所有SNP位點的43.7%，能夠導致氨基酸種類改變的非同義SNP位點有9個，占已獲所有SNP位點的56.3%。

表2 脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點信息Tab.2 SNP site information of the mitochondrial genome in ridgetail white prawn E. carinicauda

3 討 論

高分辨率熔解曲線技術是一種簡單、高效的SNP檢測方法，無需使用序列特異性探針，便可高通量檢測SNP、SSR多態性等多種遺傳變異以及相同序列的甲基化差異[20-21]。本研究基于公布的脊尾白蝦mtDNA序列，利用小片段擴增高分辨率熔解曲線檢測技術對脊尾白蝦基因組片段進行檢測。在設計的109對引物中，篩選出了9對擴增產物中存在堿基突變的引物，進一步篩選出了16個SNP位點，證明了高分辨率熔解曲線技術是篩選SNP突變位點的有效手段[22-23]。

根據美國國立生物技術信息中心數據庫得到的脊尾白蝦線粒體基因組全序列長度為15 730 bp，本研究在引物擴增區域實際檢測出了16個SNP位點，因此SNP分布頻率為0.10/100 bp。據已有的報道，不同物種中的SNP位點分布頻率存在差異，如人類基因組中SNP位點的分布頻率為0.10/100 bp，在江豚(Neophocaenaphocaenoides)中為0.18/100 bp[24]，在甲殼類的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)中為0.15/100 bp[4]，雖然本研究中脊尾白蝦的SNP位點分布頻率和以上物種的有所差異，但可以視為同一個水平上的SNP位點分布頻率。本研究中，除了在COX1、COX2、cob、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個區域中發現SNP位點以外，在其他區域均未篩查出SNP位點。其原因可能在于：一是試驗所用脊尾白蝦材料僅來自于連云港和南通兩地，雖然在取樣時盡量保證了樣本來源的多樣性，但是遺傳背景仍然較為單一；二是脊尾白蝦本身由于繁殖能力強，在同一個地區的遺傳多樣性不夠豐富[25]；三是在進化上，關鍵基因位點容錯率低，也會導致很多基因序列區檢測不到SNP位點。因此，進一步擴大篩選的樣本量，有望獲得更多在本研究中未被發現的SNP突變位點。同時，研究發現，不同基因區域的SNP位點數目存在較大差別，如在COX1區域共檢測出5個SNP位點，其次在cob區域中檢測出3個SNP位點，而在COX2和nad1區域分別只檢測出1個SNP位點。其原因可能與基因組不同部位的保守性與特異性有關，如三疣梭子蟹線粒體基因組的16S rRNA區域具有很高的保守性及特異性，與之相比，其cyt b基因的進化速率約快4倍，因此在cyt b區域發現的SNP位點數目顯著高于16S rRNA區域[26]。與同源染色體相比，線粒體基因組中的基因和SNP位點均屬單倍型，尤其是線粒體基因組為母系遺傳，一旦母體中出現新的SNP基因型，則子代個體均可遺傳這些SNP基因型，因此試驗發現的線粒體基因組SNP位點對于系譜鑒定具有重要意義。

此外，所得脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點中，轉換所占的比例為87.5%，顛換的比例為12.5%，未出現插入、缺失等突變形式。由此可見，轉換類型的SNP位點所占比例遠遠大于顛換類型，符合“transition bias”原理[27]，與劉九美等[28]在脊尾白蝦特定生長相關基因中得到的SNP位點分型規律相似。進一步對SNP位點進行定位分析和對應的氨基酸比對，發現所得SNP位點中非同義SNP位點較多，占總個數的56.3%，而同義SNP位點占43.7%，說明脊尾白蝦的線粒體基因受到正向選擇，進化速度較快。據已有研究報道，約20%～30%的非同義SNP位點能夠導致編碼蛋白質的變化，最終影響蛋白質的性質，因此非同義SNP在功能研究中更具意義[29]。另外，篩選出的9個非同義SNP位點分布于COX1、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob這6個區域中，其對于脊尾白蝦相關性狀的改變值得進一步研究，為后續脊尾白蝦遺傳育種、家系鑒定等工作的展開奠定基礎。

4 結 論

本研究通過高分辨率熔解曲線技術對脊尾白蝦mtDNA上的SNP位點進行篩查和分析，得出以下結論：

(1)本研究共篩選出16個SNP位點，分布頻率為0.10/100 bp，在脊尾白蝦mtDNA的COX1、cob、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個區域均有分布，其中COX1基因區域的SNP位點最多，其原因可能與mtDNA上不同區域的發育速度存在差異有關。

(2)所得SNP位點中只出現轉換和顛換兩種類型，其中87.5%為轉換類型，所占比例遠遠大于顛換類型；且非同義SNP位點較多，占總個數的56.3%，最終可能導致蛋白質的性質發生改變。

(3)所得線粒體基因組中的SNP位點均屬于單倍型，且具有母系遺傳特征，因此在系譜鑒定中具有重要意義。