翎電鰻卵巢發育組織學研究

哈承旭，楊翠華，王 瑋，王云忠，劉 萍

( 1.青島海洋科技館，山東 青島 266003； 2.中國水產科學研究院 黃海水產研究所， 山東 青島 266071 )

翎電鰻(Apteronotusalbifrons)，俗稱黑魔鬼魚、黑羽毛，屬裸背鰻目、翎電鰻科[1]，原產于南美洲的巴西及亞馬遜河流域。翎電鰻性格溫和，游姿輕盈美妙，是深受廣大水族愛好者喜愛的熱帶觀賞魚。翎電鰻對人工繁殖的飼養條件要求極為苛刻，目前我國翎電鰻的繁殖技術還不夠成熟，大多需要依賴進口以滿足市場需求。

現存的25 000多種魚類中，作為觀賞魚的種類有3200多種。目前對觀賞魚類的種質資源分布、養殖技術、遺傳結構分析、人工繁育、病害防治等研究均已全面展開。然而作為水族館展示的重要品種，國內外尚未見有關翎電鰻生物學研究的報道。筆者對人工養殖條件下翎電鰻卵巢的發育進行形態學和組織學觀察，旨在了解該魚的卵巢發育規律及特點，為今后翎電鰻人工繁育奠定基礎，同時完善該魚的生物學資料，填補國內外水產種質資源空白。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

2019年1月購買3月齡翎電鰻，總計202尾。

飼養于2.0 m×0.6 m×0.6 m水族箱內。飼養水溫(28±0.5) ℃，pH 7.5±0.5，光照時長16 h∶8 h(光照∶黑暗)。每日投喂線蟲及紅蟲各1次，每日按時清餌排污，日換水率5%。

1.2 樣本的數量特征測量與性腺形態觀察

取3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月齡雌性個體各10尾，測量體質量(m)、全長(LO)、體長(LB)、體高(hB)、性腺質量(mG)，進行性腺的形態學觀察并拍照。取性腺于波恩氏液中固定，固定時間24 h，后轉移至70%乙醇中保存。性腺指數(wGSI)按下式計算：

wGSI/%=mG/m×100%

1.3 組織切片的制作和觀察

采用常規石蠟組織切片方法，蘇木精—伊紅染色。在顯微鏡(Olympus BX53)下觀察、拍照。

1.4 數據分析和處理

采用Excel 2010進行數據分析，測量數據及性腺指數均使用平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件對以上數值進行單因素方差分析，檢測變化差異的顯著性。取差異顯著性水平為0.05，P≤0.05視為差異顯著，反之差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 卵巢的基本形態

翎電鰻的卵巢分為左、右兩葉，位于體腔的腹中線，緊貼于腎臟腹面兩側，卵巢發育成熟后呈囊狀。卵巢前端具有一段較短的生殖道，經泄殖孔通向體外，泄殖孔位于體前端、下頜后方(圖1)。

圖1 翎電鰻卵巢發育各期外觀結構Fig.1 Appearance and structure of ovary in different developmental stages of apteronotid eel A. albifronsa.Ⅰ期卵巢； b.Ⅱ期卵巢； c.Ⅲ期卵巢； d.Ⅳ期卵巢； e.Ⅴ期卵巢； f.Ⅵ期卵巢.a.ovary in stage Ⅰ; b.ovary in stage Ⅱ; c.ovary in stage Ⅲ; d.ovary in stage Ⅳ; e.ovary in stage Ⅴ; f.ovary in stage Ⅵ.

2.2 卵母細胞發育分期的組織學特征

Ⅰ時相：卵原細胞進行多次有絲分裂，之后向初級卵母細胞轉變。此階段細胞體積小，細胞質少，細胞核大，呈橢圓形，核內細絲狀的染色質成網狀結構，特點為細胞核較大，細胞界限不明顯(圖2a)。

Ⅱ時相：初級卵母細胞小生長期階段，呈圓形、橢圓形或多角形，細胞核和細胞質增加，細胞增大，多個細胞核分散排列，略近中央，核膜明顯，核質著色淺，早期核中可見極細棒狀染色體。核仁多個，分布于核膜內緣。濾泡細胞在卵母細胞外先是形成稀疏的濾泡膜，之后隨著濾泡細胞的增多，濾泡膜逐漸完整(圖2b)。

Ⅲ時相：初級卵母細胞體積增長顯著，由小生長期進入大生長期。其形態細胞基本呈圓球形，細胞體積明顯增大，細胞質呈現弱嗜堿性。在質膜的外側，濾泡膜由單層增為雙層，在濾泡膜和卵細胞膜之間形成放射膜。核膜呈波狀形，十幾個到數十個不等的細小核仁附在核膜上，一般未見粗大核仁存在。出現卵黃顆粒及卵黃斑。細胞質內靠近細胞膜處出現液泡，液泡隨著卵細胞的生長不斷發育，數目增加(圖2c～e)。

Ⅳ時相：初級卵母細胞進入發育鼎盛期即卵黃充滿期。細胞及細胞核直徑均有所增大。細胞核被卵黃擠到周圍以及細胞膜邊緣；核膜形狀不規則。卵黃球逐漸增多，直至幾乎充滿核外空間。只有在核周圍及靠近卵膜邊緣有較多的細胞質，呈弱嗜堿性。濾泡膜和放射膜變得更加明顯，放射帶上的條紋清晰可見。胞外膜可見濾泡細胞構成的顆粒細胞層(圖2f～g)。

Ⅴ時相：初級卵母細胞減數分裂為次級卵母細胞，核膜溶解，細胞核變形，細胞質中的卵黃顆粒逐漸融合成塊狀，呈均質紅染。成熟卵母細胞脫離濾泡膜，進入卵巢腔，成為游離卵(圖2h～i)。

2.3 卵巢的發育分期

參考文獻[2-4]的卵巢分期標準，將翎電鰻的卵巢分為6個時期，各期主要特征如下：

Ⅰ期卵巢：呈淡肉色、透明線狀，血管較少，外觀無法分辨雌雄。性腺中主要以卵原細胞為主(圖1a)。

圖2 翎電鰻的卵巢及卵母細胞發育Fig.2 Development of ovarian and oocytes of apteronotid eel A. albifronsa.4月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅱ期卵巢； b.第Ⅱ時相卵母細胞； c.6月齡雌魚卵巢橫切； d.8月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅲ期卵巢； e.第Ⅲ時相卵母細胞； f.10月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅳ期卵巢早期； g.第Ⅳ時相卵母細胞； h.產卵后雌魚卵巢橫切，示萎縮的卵巢； i.產卵后留下的空濾泡； Ⅰ.第Ⅰ時相卵母細胞； Ⅱ.第Ⅱ時相卵母細胞； Ⅲ.第Ⅲ時相卵母細胞； Ⅳ.第Ⅳ時相卵母細胞； Og.卵原細胞； SP.產卵板； N.細胞核； Nu.核仁； CY.細胞質； NM.核膜； FC.濾泡細胞； Va.液泡； YG.卵黃顆粒； G.顆粒細胞； PM.細胞質膜； ZR.放射膜； EF.空濾泡a.transverse section of ovary of 4-month-old fish, ovary in stage Ⅱ; b.oocyte in phase Ⅱ; c.transverse section of ovary of 6-month-old fish; d. transverse section of ovary of 8-month-old fish, ovary in stage Ⅲ; e.oocyte in phase Ⅲ; f.transverse section of ovary of 10-month-old fish, ovary in early stage Ⅳ; g.oocyte in phase Ⅳ; h.transection of ovary after spawning, atrophied ovary; i.empty follicles remains after spawning； Ⅰ.oocyte in phase Ⅰ； Ⅱ.oocyte in phase Ⅱ； Ⅲ.oocyte in phase Ⅲ； Ⅳ.oocyte in phase Ⅳ； Og.oogonium； SP.spawning plate； N.nucleus； Nu.nucleus； CY.cytoplasm； NM.nuclear membrane； FC.follicle cell； Va.vacuoles； YG.yolk globules； G.granule cell； PM.plasma membrane； ZR.zone radiate； EF.empty follicle.

Ⅱ期卵巢：呈肉紅色，卵巢加粗，仍有透明質感，雌雄亦不易分辨，卵巢表面及組織內部密布微血管，卵巢中較多Ⅱ時相初級卵母細胞，仍有少量卵原細胞(圖1b、圖2a)。

Ⅲ期卵巢：呈淡黃色，為膨脹的長囊狀，肉眼可見卵粒，但不能分離。組織學觀察發現，此時主要為Ⅲ時相的初級卵母細胞，少量的Ⅱ時相初級卵母細胞，后期出現少量Ⅳ時相卵母細胞(圖1c、圖2d)。

Ⅳ期卵巢：呈鮮黃色，膨脹厚實，肉眼可見黃色卵粒充滿整個卵巢。血管發達，變粗，在卵巢膜上呈網狀分布。卵巢中同時含卵原細胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相和第Ⅳ時相卵母細胞，以第Ⅳ時相卵母細胞為主(圖1d、圖2f)。

Ⅴ期卵巢：呈橙黃色，體積達到最大，卵巢中主要為第Ⅴ時相卵母細胞，第Ⅱ時相、第Ⅲ時相及第Ⅳ時相卵母細胞含量較少，卵巢壁變薄，濾泡膜破裂，卵母細胞釋放到腹腔，卵子成熟(圖1e、圖2g)。

Ⅵ期卵巢：體呈暗紅色，體積較Ⅴ期卵巢縮小。卵巢中含少量卵原細胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相初級卵母細胞以及卵子排出后留下的空濾泡(圖1f、圖2i)。

2.4 翎電鰻卵巢發育過程中生物學數據的變化

翎電鰻性腺發育情況與月齡的關系見表1。4月齡雌魚卵巢中仍含有較多的卵原細胞，發育至Ⅱ期；8月齡雌魚的卵巢中含有卵原細胞、第Ⅱ時相和第Ⅲ時相卵母細胞，發育至第Ⅲ期；10月齡雌魚的卵巢則同時存在卵原細胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相和第Ⅳ時相卵母細胞，發育至第Ⅳ期，達性成熟；11月齡雌魚卵巢中第Ⅴ時相卵母細胞占主要成分，為Ⅴ期卵巢。測量得Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm內。

翎電鰻雌魚性腺指數的變化見圖3。隨著翎電鰻性腺開始發育卵巢質量增加，親魚性腺指數開始升高，Ⅲ期時發育加速，在產卵期(卵巢Ⅴ期)時達到頂峰，為(17.9±1.3)%，顯著高于卵巢Ⅲ期時的(4.30±0.35)%。

表1 翎電鰻性腺發育與月齡的關系Tab.1 Relationship between ovarian development and months of age in apteronotid eel A. albifrons

圖3 翎電鰻雌魚性腺指數的月變化Fig.3 Monthly variations in GSI of female apteronotid eel A. albifrons

3 討 論

3.1 翎電鰻的卵巢發育特點

翎電鰻腹膜形成的卵巢囊包圍在卵巢周圍，卵巢在體腔前端相遇，形成與泄殖孔相連的輸卵管，為封閉卵巢。研究發現，翎電鰻卵母細胞發育至第Ⅱ時相晚期時形成單層濾泡膜，在第Ⅲ時相卵母細胞中濾泡膜經分化成為內、外兩層，外層為鞘膜細胞層，內層為顆粒細胞層，這與鲇魚(Silurusasotus)[5]的濾泡發育過程相似。在翎電鰻的卵黃發生過程中，卵黃物質有液泡(又被稱為卵黃泡)和卵黃顆粒兩種類型。第Ⅲ時相卵母細胞內首先在胞質較外側出現液泡，由一個發展成為一層，再逐步由胞質外側向胞質中央不斷擴展；卵黃顆粒晚于液泡出現，逐漸融合增大成為球狀和板狀卵黃，長薄鰍(Leptobotiaelongate)[6]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[7]等的卵黃發育過程與此相同。此外還發現，第Ⅲ時相卵母細胞開始出現放射膜，后期伴隨著翎電鰻卵母細胞的發育，由于微絨毛相互從卵膜上縮回，導致放射膜厚度逐漸減小，在國內外不少專家學者的研究中發現了此類現象[8]，如東海鰳魚(Ilishaelongata)[9]，甚至有些魚類在卵母細胞成熟過程中放射帶會基本消失，如東海銀鯧(Pampusargenteus)[10]。

3.2 翎電鰻的產卵類型分析

根據卵母細胞的發育情況，大多數硬骨魚類的卵巢發育模式可分為同步型和非同步型，同步型產卵模式又分為完全同步型和分批同步型2種類型[11-12]。完全同步型，卵巢內的卵母細胞都處于同一發育時期，通常一生只產卵一次就死亡，如大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[13]、黃尾密鲴(Xenocyprisdavidi)[14]。分批同步型，卵巢內存在兩種或兩種以上的卵母細胞類型，通常每年只產卵一次，如黃海高眼鰈(Cleisthenesherzensteini)[15]、圓斑星鰈(Veraspervariegates)[16]、美洲鰣(Alosasapidissima)[17]和雙須骨舌魚(Osteoglossumbicirrhosum)[18]等。分批非同步型，卵巢內存在各種時相的卵母細胞類型，通常一年內產卵多次，如斑馬魚(Daniorerio)[19]、青鳉(Oryziaslatipes)[20]、七彩神仙魚(Symphysodonsp.)[21]等。觀察顯示，翎電鰻在形成多個Ⅳ時相卵母細胞的同時仍保持有Ⅲ時相和Ⅱ時相卵母細胞,也保留了一定數目的卵原細胞，各時相的細胞都占有一定的比例。Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm內，呈現出明顯的分批產卵特征。即當翎電鰻親魚在營養積累充足且養殖環境理想的狀態下，短時間內存在一批卵排出后新一批次的卵成熟并被釋放的可能，因此翎電鰻卵巢發育規律應判定為分批同步型。魚類的分批產卵主要是卵巢發育的不同步造成的，自然界中，分批產卵魚對環境的適應能力更好，子代不會因為一次突發性的環境災難就全軍覆沒；然而在生產環節，魚類的分批產卵屬性會對卵的收集增加一定難度，為人工繁殖制造了障礙。

3.3 翎電鰻的性腺發育指數

本試驗中，翎電鰻達性成熟時，雌魚平均性腺指數為17.9%。多數同步型卵巢發育模式性腺指數比非同步型性腺指數要高，美洲鰣魚雌魚成熟性腺指數為18.47%[17]，黃尾密鲴雌魚性成熟的性腺指數為18.6%[14]。而分批非同步產卵類型的七彩神仙魚達性成熟時雌魚的平均性腺指數僅為0.712%[21]。

魚類的性腺發育受到自身激素水平的調節，此外環境因子也對魚類的生殖活動產生影響[22]。諸多環境因子如氣象水文因子(水溫、光照)、水體理化因子(鹽度、pH)、餌料及產卵基質等均能對魚類的生殖過程產生影響[23-24]。Bonnet等[25]發現，在產卵時改變光照周期會阻礙虹鱒卵母細胞發育，顯著降低卵子的質量。人工飼養條件下，因餌料充沛且水質條件較好，翎電鰻性腺發育的速度較快，但翎電鰻產卵時對環境因子要求極高，當受到環境脅迫或成熟的卵子未能成功排出時，肉眼明顯可見解剖后卵巢有褐色閉鎖卵母細胞。目前，人工養殖下翎電鰻繁殖率較低，如何改善影響其性成熟及順利排卵的環境因子是目前研究的主要內容。

4 結 論

通過常規石蠟切片方法對人工飼養條件下雌性翎電鰻卵巢的發育情況進行分析，根據其外部形態并結合切片顯微觀察，將翎電鰻卵巢發育分為6個時期，卵子發育分為5個時相。隨著翎電鰻性腺開始發育卵巢逐漸增大，Ⅲ期時發育加速，在產卵期(卵巢Ⅴ期)時達到頂峰，顯著高于發育前水平。翎電鰻卵巢在發育形成多個Ⅳ時相卵母細胞的同時仍保持有Ⅲ時相和Ⅱ時相卵母細胞，也保留了一定數目的卵原細胞，各時相的細胞都占有一定的比例。翎電鰻Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布于兩個區間，卵巢發育規律為分批同步型。