中介素對急性腎衰竭的腎臟保護作用

崔艷麗，何利珍，李小亮

作者單位：焦作市第二人民醫院檢驗科，河南 焦作454000

急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）在臨床上的發生率非常高的，而腎臟缺血/再灌注損傷（renal ischemia/reperfusion injury，I/R）是其主要原因［1］。研究表明，ARF的預后不僅取決于損傷的嚴重程度，而且取決于損傷后腎臟修復和再生情況，因此減輕急性期損傷和促進腎組織再生的因素均能改善ARF的預后。中介素是降鈣素基因相關肽超家族的新成員［2］，可非選擇性結合于該家族的共同受體即降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白系統，具有廣泛的生物學效應［3］，在調節心血管、消化、泌尿、呼吸以及神經內分泌功能等方面有著重要的作用［4］。

目前關于中介素的研究多集中與動物器官、細胞水平，關于基因信號通路的報道尚較少，也沒有相應的臨床試驗，故從磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和哺乳動物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，m TOR）信號通路（PI3K/Akt/mTOR信號通路）探討中介素對器官的保護作用及其機制，對后續的轉化醫學研究尤為重要。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E細胞購自美國ATCC；中介素購自Phoenix；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等抗體購自美國CST公司；自噬標志蛋白beclin-1、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）和β-actin抗體購自Abcam公司；聚偏二氟乙烯膜購自Millipore公司；ECL發光液購自Thermo公司；RT-PCR試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司；中介素快速檢測酶聯免疫吸附試劑盒購于上海桑戈生物科技有限公司，生產批號18101913。其余試劑均為國產分析純。

1.2 樣本采集及檢測 采集焦作市第二人民醫院2015年12月至2018年6月間確診的急性腎衰竭病人45例，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。所有研究對象入院24 h內晨起空腹采集肘靜脈血5 mL，室溫條件下靜置30 min，3 000×g離心15 min后抽取血清，置于收集管中，-80℃冰箱中保存。酶聯免疫吸附試驗測定血清中介素水平。

1.3 NRK-52E細胞培養和處理 NRK-52E細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，5%二氧化碳，37℃條件下培養箱中培養。采用對數生長期的細胞進行實驗。實驗分組：①對照組，正常細胞，不做任何處理；②I/R模型組，細胞進行缺氧/復氧處理，不加任何干預物；③中介素干預組，加入不同濃度的中介素（2，4，6 μmol/L）進行干預；④PI3K抑制劑LY290042組；⑤中介素+LY290042干擾組。

1.4 NRK-52E細胞缺氧/復氧模型的建立 NRK-52E細胞放置于無血清培養基中，在含有1%氧氣，5%二氧化碳和94%氮氣條件下的培養箱內培養6 h，然后將細胞置于正常培養條件下培養12 h。③④⑤組的細胞在進行缺氧/復氧實驗前加入相應試劑預處理4 h。

1.5 MTT比色法檢測細胞活性 將NRK-52E細胞接種于96孔板，加入不同濃度的中介素（2、4、6 μmol/L）作用48 h后，采用MTT法檢測NRK-52E細胞的存活情況。每孔加入20 μL 0.5%的MTT溶液，37℃條件下孵育4 h，棄去培養基，然后每孔加150 μL二甲基亞砜，緩慢振蕩10 min后，于波長為490 nm處測定OD值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 NRK-52E細胞與中介素（4 μmol/L）作用后，收集細胞，將細胞重懸于400 μL緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻后避光孵育15 min。加入10 μL PI染液，混勻后冰浴避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達 用預冷PBS漂洗2次后加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，將刮下的細胞轉移至1.5 mL離心管中，于冰上裂解30 min后，用超聲波細胞破碎儀間歇裂解30 s，12 000 r/min離心10 min后收集上清液。將制備好的蛋白樣品（40 μg）采用12%SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）垂直電泳進行分離，電泳分離后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h，4℃條件下孵育一抗過夜。次日用TBST 110 r/min振蕩培養，洗滌5次，二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌，用發光液顯影檢測PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白的表達水平。

1.8 RT-PCR檢測mRNA水平 Trizol法提取NRK-52E細胞總RNA，使用試劑盒進行反轉錄。擴增引物均由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，引物序列見表1。PCR擴增條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環。用β-actin做內參，得到相對表達量，實驗重復3次后進行統計分析。

表1 引物序列

1.9 統計學方法 運用GraphPad Prism 6進行數據分析。觀測數據主要是計量數據，以s表示，多組比較為單因素方差分析，兩組比較為成組t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性腎衰竭與健康體檢者血清中中介素水平比較 45例ARF組血清中介素水平為（6.4±2.2）ng/mL，顯著高于對照組水平（2.4±1.2）ng/mL，差異有統計學意義（t＝10.707，P＝0.000），說明ARF病人血清中介素表達上調，提示中介素可能在急性腎衰竭病理生理過程中發揮作用。

2.2 中介素對NRK-52E細胞活性的影響 NRK-52E細胞經過缺氧/復氧實驗后，細胞的存活率為（45.3±4.5）%，與對照組（100±1.4）%相比顯著下降（P＜0.05）。采用不同濃度的中介素（2、4μmol/L、6μmol/L）對細胞進行干預后，細胞存活率分別為（55.9±2.6）%，（75.4±3.2）%和（86.7±2.9）%，與缺氧/復氧模型組相比顯著上升（P＜0.05）。表明中介素對NRK-52E細胞的缺氧/復氧過程有保護作用。

2.3 中介素對NRK-52E細胞凋亡的影響 采用流式細胞術對處理后的NRK-52E細胞進行測定。結果表明缺氧再復氧后，細胞發生了嚴重的細胞凋亡現象，凋亡率為（42.3±3.6）%，與對照組（10.2±1.7）%相比顯著上升（P＜0.05）。經過中介素（4 μmol/L）預孵育4 h的細胞凋亡率為（27.6±3.1）%，與缺氧/復氧模型組相比顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

2.4 中介素對NRK-52E細胞自噬水平的影響Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ是細胞自噬過程中的標志性分子，當自噬體形成過程中，LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ跟PE結合轉變為（自噬體）膜型（即LC3-Ⅱ），因此，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的來評估自噬水平。本研究采用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測細胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平。圖2結果表明，缺氧/復氧后的細胞beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，中介素（4 μmol/L）干擾組的細胞beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），細胞自噬顯著增強。

圖1 中介素對腎小管上皮細胞（NRK-52E）細胞凋亡的影響

圖2 中介素對腎小管上皮細胞（NRK-52E）細胞自噬水平的影響：A示蛋白質印跡法檢測電泳圖；B示NRK-52E細胞中beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白水平；C示NRK-52E細胞中beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA水平

2.5 中介素對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響 不同濃度的中介素（2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L）處理細胞24 h后，利用蛋白質印跡法檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達情況。結果如圖3所示：在一定濃度范圍內，隨著中介素濃度的升高，PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平逐漸下降。與對照相比，PI3K蛋白磷酸化水平在2 μmol/L時顯著下降，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平變化同樣顯著下降（P＜0.05）；當中介素濃度大于4 μmol/L時PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平極顯著下降（P＜0.01），表明中介素可以通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而誘導自噬的發生。

圖3 中介素對磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和哺乳動物雷帕霉素蛋白（m TOR）信號通路相關蛋白表達影響：A示蛋白質印跡法檢測電泳圖；B示不同濃度中介素誘導下，PI3K、Akt、mTOR表達水平

2.6 PI3K抑制劑對中介素誘導NRK-52E細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達和自噬標志性蛋白的影響 為了進一步驗證PI3K/Akt/mTOR信號通路在自噬中過程中的作用，使用PI3K抑制劑LY294002處理細胞，蛋白質印跡法檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路及自噬相關蛋白的表達。結果顯示：LY294002+中介素處理組與中介素處理組相比，Akt蛋白的磷酸化水平、mTOR蛋白的磷酸化水平極顯著下降（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達量極顯著升高（P＜0.01）），單獨使用中介素、PI3K抑制劑LY294002，mTOR蛋白的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高（P＜0.05）），表明PI3K/Akt/mTOR信號通路中介素在細胞自噬中起負調控作用。見圖4。

圖4 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制劑對蛋白激酶B（Akt）和哺乳動物雷帕霉素蛋白（m TOR）信號通路和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達的影響：A示蛋白質印跡法檢測電泳圖；B示PI3K抑制劑LY294002干預下，中介素誘導的Akt、mTOR、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平

3 討論

中介素作為CGRP超家族的新成員，由于其強大的生物學效應和廣泛的多系統作用特性，在心腦血管、消化、泌尿、呼吸以及代謝等多種疾病的發生發展過程中可能發揮著重要的作用。近年來研究發現，中介素可以通過對抗長期氧化應激、抑制細胞凋亡等多種機制［5］，減輕心、腦、I/R損傷，并具有穩定血管內皮屏障、減輕血管滲漏等活性。有研究表明中介素在腎臟有大量表達，作為一種內源性調節肽中介素對腎臟的進展性損傷有一定的保護作用［6］。有報道指出中介素對腎血管有舒張作用［7］，向大鼠腎動脈注射中介素（100 pmol·kg-1·min-1）可增加腎血流量，但是血壓和心率沒有變化。邱淑怡、高云［8］嘗試大鼠靜脈注射中介素可引起血壓下降，腎血流量增加、腎交感神經活性增加，停止注射后血壓恢復至基礎水平，而腎血流量在停止注射60 min后仍有顯著增高［9］。

自噬是細胞維持自身內平衡的一個分解代謝過程［10］，自噬表現為細胞生長過程中形成的能夠降解長壽命蛋白以及自體多余的或失去功能的細胞器的功能，從而維持細胞的正常功能［11］。自噬的信號通路主要為兩種：腺苷酸活化激酶信號通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路［12］，前者主要受胞內能量水平影響，而后者主要感受營養狀況和生長因子等多種胞外影響因素，調控細胞周期、翻譯、轉錄和代謝，其中PI3K/Akt/mTOR通路在腫瘤的發生發展中起重要作用［13］。有研究表明，在腎癌中PI3K/Akt/mTOR信號途徑上調S期激酶相關蛋白2蛋白表達，從而激活mTORC1，進而促進細胞增殖［14］。

缺血再灌注損傷與氧化應激，線粒體功能紊亂等機制有關［15］，而自噬在腎臟缺血再灌注過程中起到重要作用，自噬不足能夠引起腎臟損傷［16］。有報道表明中介素能夠提高小鼠結腸炎中的自噬水平從而緩解結腸炎癥狀［17］。自噬代表了一種修復，維持生命的過程。mTOR是自噬重要的調控因子之一［18］，可感知細胞的營養狀況和細胞應激。PI3K和Akt是mTOR重要的上游調控因子，Ⅰ型PI3K可以激活Akt，活化的Akt進一步磷酸化mTOR。PI3K抑制劑LY294002可降低Akt蛋白的磷酸化水平，下調PI3K/Akt/mTOR通路，誘導細胞自噬水平上升。近年來，該通路作用的研究受到重視［19］，應用抑制劑對該通路進行干預，體外實驗證實均能抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡［20］。

本研究結果表明，急性腎衰竭病人血清中中介素表達水平明顯高于健康對照組者，大鼠腎小管上皮細胞經過缺氧/復氧處理后，模擬急性腎衰竭腎臟缺血再灌注過程，細胞的存活率顯著下降。采用中介素對細胞進行干預后，自噬標志蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平升高，細胞存活率顯著上升。隨著中介素濃度的升高，PI3K/Akt/mTOR信號通路中的關鍵蛋白磷酸化水平下降，表明中介素可以激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。在加入PI3K抑制劑LY294002（10 μmol/L）同樣發現，自噬蛋白表達量增多，PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達量顯著減少。

總之，中介素在一定濃度范圍內，可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞自噬的發生，該信號通路的對自噬發生起負調控作用，調控自噬的信號通路PI3K/Akt/mTOR的激活在急性腎衰竭過程中起保護作用。