給藥途徑及杞歸八味口服液對大鼠二苯乙烯苷藥代動力學的影響*

傅若秋，王顯鳳，張 琳，段冬玉，陳劍鴻

（中國人民解放軍陸軍特色醫學中心藥劑科，重慶 400042）

杞歸八味口服液（曾用名益精靈口服液）為我院特色自制制劑，由何首烏、枸杞子、菟絲子、牛膝、當歸、補骨脂、茯苓、陳皮8 味中藥組方，具有健腦安神、滋補肝腎功效，用于失眠多夢、健忘、腰膝酸軟、神疲乏力等癥，療效顯著，已在臨床使用近30 年。何首烏為方中君藥，主要水溶性成分為二苯乙烯苷（2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－ O－β－D－葡萄糖苷），為何首烏的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、神經保護等多種藥理學活性［1－6］。同時，二苯乙烯苷也是2015 年版《中國藥典（一部）》規定的何首烏質量檢測指標成分，杞歸八味口服液質量標準也將其作為指標成分［7］，但在胃腸道中不易吸收［8－9］。為了解不同給藥途徑及中藥復方對二苯乙烯苷藥代動力學的影響，本研究中考察了腹腔注射、灌胃2 種給藥途徑，以及杞歸八味口服液灌胃情況下，二苯乙烯苷在大鼠體內的藥代動力學特征。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

LC－20AT 型高效液相色譜（HPLC）儀［配有SPD－20A型紫外（UV）檢測器、SIL－20AC 型自動進樣器，日本島津公司］；BT25S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Vortex－5 型渦旋儀（海門其林貝爾公司）；CS15 型高速低溫離心機（美國貝克曼公司）。

1.2 試藥

二苯乙烯苷對照品（批號為19051603，含量為99.44% ），虎杖苷對照品（批號為19062702，含量為98.26%），均購自成都曼思特生物科技有限公司；杞歸八味口服液（本院自制，批號為200415，二苯乙烯苷含量為4.10 mg／mL）；甲醇（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；純化水（實驗室自制）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD 大鼠15 只，雄性，體質量（260±10）g，陸軍特色醫學中心動物實驗中心提供，動物實驗許可證號為SYXK（軍）2017－0058，動物實驗符合動物實驗倫理委員會《實驗動物福利倫理原則》要求。動物均予普通飼料喂養，給藥前12 h 禁食不禁飲，置溫度為23 ～27 ℃、相對濕度為45% ～55%、自然光照條件下的動物實驗房內。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－水（40 ∶60，V／ V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

取二苯乙烯苷對照品10.80 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，得質量濃度為1 080 μg／mL的對照品貯備液，按倍數稀釋法用甲醇稀釋成質量濃度為1 080.00，540.00，270.00，67.50，16.90，8.44，4.22，2.11，1.06 μg／mL 的系列對照品溶液。取虎杖苷對照品2.30 mg，精密稱定，用1 mL 甲醇溶解，配成質量濃度為2.30 mg／mL 的虎杖苷內標貯備液，取貯備液適量，用甲醇稀釋100 倍，得質量濃度為23.0 μg／mL的虎杖苷內標溶液。取二苯乙烯苷適量，精密稱定，用生理鹽水溶解，配成質量濃度為8 mg／mL（供腹腔注射用）及4 mg／mL（供灌胃用）的二苯乙烯苷溶液。按生產工藝制備，并按質量標準檢測合格的杞歸八味口服液（二苯乙烯苷含量為4.1 mg／mL）。

2.3 血清樣品處理

取大鼠血清100 μL，加虎杖苷內標溶液50 μL，甲醇360 μL，渦旋30 s，14 000 r／min 離心5 min，取上清液10 μL，進樣，進行定量分析。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別取大鼠空白血清、空白血清加二苯乙烯苷，大鼠給藥后（二苯乙烯苷腹腔注射、二苯乙烯苷灌胃、杞歸八味口服液灌胃）的血清樣品，按2.3 項下方法處理血清樣品，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果二苯乙烯苷與內標虎杖苷的保留時間分別為10.14 min 和8.75 min，分離度大于1.5，血清中內源性物質不干擾二苯乙烯苷和內標的測定。詳見圖1。

線性關系考察及檢測限、定量限確定：取空白血清100 μL，精密加入不同質量濃度的二苯乙烯苷甲醇溶液10 μL，渦旋混勻，使血清中二苯乙烯苷質量濃度分別 為108.000，54.000，27.000，6.750，1.690，0.844，0.422，0.106 mg／L，按2.3 項下方法處理血清樣品（甲醇加入量為350 μL），按2.1 項下色譜條件進樣測定。以二苯乙烯苷峰面積與虎杖苷峰面積的比值（Y）為縱坐標、二苯乙烯苷質量濃度（X，mg／L）為橫坐標進行線性回歸，并繪制標準曲線，回歸方程為Y ＝0.077 568X ＋0.002 861，r ＝0.999 9（n ＝8）。結果表明，二苯乙烯苷質量濃度在0.106 ～108.000 mg ／ L 范圍內與二苯乙烯苷峰面積和虎杖苷峰面積的比值線性關系良好。檢測限（S／ N ＝3）為0.025 mg／L，定量限（S／ N ＝10）為0.106 mg／L。

加樣回收試驗和精密度試驗：依法制備二苯乙烯苷低、中、高質量濃度（0.422，6.750，54.000 mg／L）的模擬血清樣品各6 份，按2.3 項下方法處理血清樣品（甲醇加入量為350 μL），按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄二苯乙烯苷及內標虎杖苷的峰面積，并代入線性回歸方程計算模擬血清樣品中二苯乙烯苷的質量濃度（即測得質量濃度）。結果見表1。

表1 加樣回收試驗和精密度試驗結果Tab.1 Results of the recovery test and the precision test

穩定性試驗：依法制備二苯乙烯苷低、中、高質量濃度（0.422，6.750，54.000 mg／L）的模擬血清樣品各6 份，考察模擬血清樣品室溫放置4 h、反復凍融3 次、－20 ℃凍存15 d，以及按2.3 項下方法處理后于4 ℃放置24 h 的穩定性。結果見表2，表明在不同條件下，模擬血清樣品中的二苯乙烯苷均穩定（RSD≤10%）。

表2 穩定性試驗結果（n ＝6）Tab.2 Results of the stability test（n ＝6）

2.5 藥代動力學試驗

將健康雄性SD 大鼠隨機分為A 組（60 mg／kg 二苯乙烯苷、腹腔注射）、B 組（60 mg／kg 二苯乙烯苷、灌胃）、C 組［杞歸八味口服液（相當于60 mg／kg 二苯乙烯苷）、灌胃］，各5 只，禁食不禁飲12 h 后，分別給予相應藥物，于給藥后2，5，10，15，20，30，45，60，90，120，180，240 min 時剪尾取血300 ～400 μL，分離，收集血清，于－20 ℃保存待測。取血清樣品，按2.3 項下方法處理，按2.1 項下色譜條件進樣測定5 次，記錄二苯乙烯苷及內標虎杖苷的峰面積，代入線性回歸方程，計算不同時間點血清藥物濃度（見表3），并以時間（X，min）為橫坐標、血藥濃度（Y，mg／L）為縱坐標繪制平均血藥濃度－時間曲線（見圖2）。

表3 3 組大鼠各采血時間點的血藥濃度（ ± s，mg／L，n ＝5）Tab.3 The plasma concentration of rats in the three groups at each time point（ ± s，mg／L，n ＝5）

表3 3 組大鼠各采血時間點的血藥濃度（ ± s，mg／L，n ＝5）Tab.3 The plasma concentration of rats in the three groups at each time point（ ± s，mg／L，n ＝5）

采血時間點（min）A 組B 組C 組25 10 15 20 30 45 60 90 120 180 240 11.56±4.05 21.67±7.79 19.73±2.90 16.31±5.83 11.38±4.60 6.41±2.74 3.02±1.31 1.81±1.42 0.61±0.32 0.27±0.18 0.10±0.11 0.07±0.08 0.05±0.06 0.07±0.10 0.41±0.51 0.31±0.38 0.25±0.19 0.10±0.04 0.04±0.02 0.02±0.02 0.01±0.01 0.01±0.02 0.00±0.00 0.00±0.00 0.02±0.04 0.01±0.02 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

圖2 平均血藥濃度－時間曲線圖Fig.2 The profile of mean plasma concentration－time

血藥濃度數據采用DAS 1.0 軟件進行擬合，計算藥代動力學參數，并采用SPSS 13.0 統計學軟件分析。結果顯示，A 組、B 組大鼠的藥代動力學過程均符合血管外給藥二室模型，大鼠腹腔注射及灌胃后二苯乙烯苷均能快速進入體循環，給藥后2 min 即能在血中檢測到藥物，其平均達峰時間（tmax）分別為（9.0±4.2）min 和（14.0±5.5）min；但二苯乙烯苷灌胃進入體循環的藥量很少，其平均峰濃度（Cmax）、血藥濃度時間－曲線下面積 AUC0－240min和 AUC0－∞分 別 只 有 腹 腔 注 射 的1.85%，1.38%，1.39%（見表4）；而灌胃給予杞歸八味口服液后進入體循環的二苯乙烯苷就更少，各時間點的血藥濃度大多低于檢測限（0.025 mg／L），導致有效血藥濃度數據點太少而無法擬合藥代動力學參數。

表4 二苯乙烯苷主要藥代動力學參數（ ± s，n ＝5）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of stilbene glucoside（ ± s，n ＝5）

表4 二苯乙烯苷主要藥代動力學參數（ ± s，n ＝5）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of stilbene glucoside（ ± s，n ＝5）

注：與A 組比較，*P ＜0.01。t1 ／2ka 為吸收半衰期，t1 ／2α 為分布相半衰期，t1 ／2β 為消除相半衰期。Note：compared with those in group A，* P ＜ 0.01. t1 ／2ka is the half－life for the absorption phase，t1 ／2α is the half－life for the distribution phase，t1 ／2β is the half－life for the elimination phase.

藥代動力學參數tmax（min）Cmax（mg／L）t1 ／2ka（min）t1 ／2α（min）t1 ／2β（min）AUC0 －240 min（mg·min／L）AUC0 －∞（mg·min／L）A 組B 組9.00±4.18 23.79±7.12 1.30±1.51 11.02±4.96 41.81±34.26 431.84±77.70 435.89±75.69 14.00±5.48 0.44±0.40 *23.31±41.62 8.08±5.08 12.90±4.86 5.96±6.73 *6.04±6.68 *

3 討論

血清樣品采用甲醇直接沉淀蛋白，14 000 r／min 離心，取上層血清進樣，相比濾膜過濾，具有所需血樣少、操作簡便快速、結果穩定等優點。曾考慮采用氮吹濃縮的方法濃縮樣品，以提高檢測靈敏度，但由于二苯乙烯苷為水溶性成分，有機溶劑萃取回收率極低，導致靈敏度反而下降；而甲醇沉淀離心后的上層血清中因含有水分，導致氮吹濃縮的效率極低，且精密度不高，變異性太大。故仍采取4 倍量甲醇直接沉淀蛋白的方法進行樣品處理，檢測限和定量限分別為0.025 mg／L 和0.106 mg／L，基本能滿足檢測需要。

藥代動力學研究中，大鼠采血多從眼眶靜脈叢采血［10－12］，但存在以下缺點：1）操作時對動物刺激較大，大鼠容易掙扎，采血時間準確性易受影響；2）同一只眼睛多次采血后，不容易采出血來；3）血樣溶血的發生率較高；4）毛細管反復扎眼角，在感官上易給操作者帶來心理負擔。因此，本試驗采用剪尾取血的方法采集血樣，將大鼠置倒扣的泡沫盒中，露出尾巴，剪掉尾尖約1.5 cm，從尾根向尾尖方向輕輕擠壓，即可順利采血。大鼠由于處于黑暗環境，且采血手法輕柔，較安靜配合，給藥后采血時間易控制（可控制在±30 s 內），同一創口可多次采血，每次可采血300 ～400μL（可分離出血清150 ～200μL），且基本無溶血現象。

二苯乙烯苷是何首烏的主要活性成分之一［3，13－14］，但其在胃腸道吸收不佳［15］，本研究結果也證實了此現象，且二苯乙烯苷口服給藥的生物利用度只有腹腔注射的1.38%。何首烏是中藥復方制劑杞歸八味口服液的君藥，其二苯乙烯苷含量也是杞歸八味口服液質量檢測的指標成分，但其復方成分并不促進二苯乙烯苷在胃腸道的吸收，反而使吸收變差，導致血藥濃度大多低于檢測限（0.025 mg／L）；由于杞歸八味口服液中二苯乙烯苷的臨床等效口服劑量僅相當于本試驗中二苯乙烯苷所用劑量（60 mg／kg）的20%，甚至更低，故推測二苯乙烯苷可能不是杞歸八味口服液發揮藥理作用的活性物質。