60Co－γ 射線輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉品質(zhì)的影響研究*

韓振明，關(guān)永霞，張 微，馬 云，張貴民

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006； 2. 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006）

蜈蚣為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch 的干燥體，可息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)［1］，含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂肪酸、多糖、微量元素等成分，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抑菌［2－6］等多種藥理活性。蜈蚣生粉入藥的中藥處方制劑有多種，如脈絡(luò)舒通丸、蝎蜈顆粒、蜈蚣敗毒飲等，可用于多種疾病的治療［7－10］。動(dòng)物藥材中的多肽、多糖等成分為微生物的繁殖提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，在加工、貯存過(guò)程中極易霉變，導(dǎo)致微生物含量超標(biāo)，對(duì)臨床的用藥安全產(chǎn)生極大威脅，故中藥處方制劑生產(chǎn)過(guò)程中藥材滅菌的前處理尤為重要。現(xiàn)階段，已有較多射線相關(guān)研究及應(yīng)用，60Co－γ 射線多見(jiàn)于醫(yī)學(xué)診斷及工業(yè)探測(cè)領(lǐng)域［11－12］，在食品藥品的消毒滅菌中也有應(yīng)用。60Co－γ 射線輻照滅菌法已應(yīng)用于多種藥材飲片的滅菌，高效，操作簡(jiǎn)單，穿透力強(qiáng)，速度快，可用于含熱敏性成分藥材的滅菌，具有滅菌徹底、無(wú)污染、無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì)。有人對(duì)多種藥材進(jìn)行60Co－γ 射線輻照滅菌法的可行性研究，如黃精、地黃、龍膽、黃芩、天南星、蟬蛻等［13－14］。劉濱思等［15］曾考察3 種滅菌方法對(duì)蜈蚣有效成分及沙門(mén)菌滅菌效果的影響，與干熱滅菌、濕熱滅菌相比，60Co－γ 射線輻照滅菌效果最好，但未對(duì)蜈蚣藥粉輻照滅菌劑量進(jìn)行優(yōu)化研究。本研究中探討了不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉8 種核苷成分及微生物指標(biāo)的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌種

儀器：Agilent 1100 型高效液相色譜（HPLC）儀［包括二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、四元低壓梯度泵、Agilent Open Lab 型色譜工作站，安捷倫科技有限公司］；Toledo LE204E 型電子分析天平（精度為十萬(wàn)分之一），01193－YP601N 型電子分析天平（精度為萬(wàn)分之一），均購(gòu)于梅特勒－托利多集團(tuán)；KQ5200E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；JD－CJ－1A 型超凈工作臺(tái)（蘇州金大凈化工程設(shè)備有限公司）；BJPX－200 型生化培養(yǎng)箱（濟(jì)南翔天生物科技有限公司）；粉碎機(jī)；80 目藥篩。

試藥：蜈蚣購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)魯南厚普制藥有限公司質(zhì)檢中心高級(jí)工程師范建偉鑒定為正品，符合2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》來(lái)源規(guī)定；乙腈（批號(hào)為20185187），甲醇（批號(hào)為20193307），均為色譜純，購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇（色譜純，批號(hào)為181217871G），磷酸（色譜純，批號(hào)為191115647F），甲醇（分析純），均購(gòu)于南京化學(xué)試劑股份有限公司；有機(jī)濾頭（愛(ài)西默科技有限公司，孔徑為0.22 μm）。

菌種：胰酪大豆胨瓊脂（批號(hào)為HB4114－04），沙氏葡萄糖瓊脂（批號(hào)為HB025381），均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；大腸埃希菌（菌號(hào)為43094，成都生物制品研究所）；乙型副傷寒沙門(mén)菌（菌號(hào)為50699，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心）。

1.2 方法

輻照滅菌方法：將蜈蚣藥材粉碎，過(guò)80 目藥篩，保存，備用。稱取藥粉15 份，每份200 g，以無(wú)菌自封袋密封，分別編號(hào)1 ～15 號(hào)，分為5 組進(jìn)行試驗(yàn)，每組3 份。參考原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》（2015 年第86 號(hào)）及文獻(xiàn)［16］，得知中藥最大總體平均輻照劑量不超過(guò)10 kGy，故輻照試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。蜈蚣藥粉1 ～3 號(hào)無(wú)操作，為陰性對(duì)照組（0 kGy60Co－γ 射線）；其余12 份（4 ～15 號(hào)）分別以4，6，8，10 kGy60Co－γ 射線進(jìn)行動(dòng)態(tài)輻照滅菌操作，為試驗(yàn)組；菌種活化培養(yǎng)為對(duì)照組。觀察并記錄試驗(yàn)組與對(duì)照組的藥粉外觀性狀。

藥典檢查指標(biāo)測(cè)定：照2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》藥材蜈蚣項(xiàng)下［1］要求，對(duì)經(jīng)不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉進(jìn)行檢查項(xiàng)測(cè)定，包括水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸溶性浸出物、重金屬及有害元素、黃曲霉毒素等。

微生物限度檢查：照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105 及通則1106［17］，對(duì)經(jīng)不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉進(jìn)行微生物限度檢查，包含需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)等，同時(shí)按上述檢查方法對(duì)大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行活化及接種培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

化學(xué)成分含量測(cè)定：張琪等［18］的研究中，采用HPLC－DAD 法對(duì)經(jīng)不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌的蜈蚣藥粉的化學(xué)成分進(jìn)行定量分析，包括胞嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脫氧肌苷、胸苷8 種。以上8 種核苷類成分分離良好，在一定質(zhì)量濃度內(nèi)的線性關(guān)系良好（r ＞0.999），精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD 均小于3.0%，準(zhǔn)確度試驗(yàn)在95% ～102%范圍內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 軟件和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，包括方差分析（ANOVA）和直觀分析。

表1 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉藥典檢查指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination of inspection indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder（according to the Chinese Pharmacopoeia）sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation

2 結(jié)果

2.1 滅菌后性狀

經(jīng)觀察，各批次蜈蚣藥粉滅菌前后外觀性狀均無(wú)明顯差異，藥粉顯灰綠色，有刺鼻腥臭味；5 個(gè)試驗(yàn)組蜈蚣藥粉的形態(tài)、顏色、氣味均一穩(wěn)定。

2.2 藥典檢查指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。可見(jiàn)，各試驗(yàn)組蜈蚣藥粉中水分、總灰分、酸不溶性灰分、總黃曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金屬及有害元素各指標(biāo)均符合2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》項(xiàng)下限度要求，各試驗(yàn)組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

2.3 微生物限度檢查結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，未經(jīng)60Co－γ 射線輻照的陰性對(duì)照組需氧菌總數(shù)為10 000 cfu／g，霉菌和酵母菌總數(shù)為120 cfu／g，耐膽鹽革蘭陰性菌個(gè)數(shù)小于10 cfu／g，未檢出大腸埃希菌與沙門(mén)菌，其中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》標(biāo)準(zhǔn)（需氧菌總數(shù)不得超出3 500 cfu／g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得超出50 cfu／g）；經(jīng)4 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗(yàn)組需氧菌總數(shù)急劇降低，較陰性對(duì)照組減少了87%，需氧菌總數(shù)與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)，隨著輻照劑量的增加，需氧菌總數(shù)迅速減少，輻照劑量增加至10 kGy 時(shí)，需氧菌總數(shù)降至小于10 cfu／g；霉菌和酵母菌總數(shù)經(jīng)4 kGy60Co－γ 射線輻照滅菌后總數(shù)比陰性對(duì)照組降低了25%，繼續(xù)增加輻照劑量，霉菌和酵母菌總數(shù)持續(xù)降低，最后降至輻照劑量為8 kGy 時(shí)的10 cfu／g 以下；2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》要求蜈蚣藥材中耐膽鹽革蘭陰性菌不得大于100 cfu／g，5 個(gè)試驗(yàn)組中，耐膽鹽革蘭陰性菌含量均小于10 cfu／g，符合要求。此外，試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)論是否接受60Co－γ 射線輻照滅菌，均未檢出大腸埃希菌與沙門(mén)菌，由菌種活化后在相同培養(yǎng)條件下接種培養(yǎng)的樣品可檢出大腸埃希氏菌與沙門(mén)菌（見(jiàn)表3 中對(duì)照試驗(yàn)數(shù)據(jù)）。

表3 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（cfu／g）Tab.3 Determination of hygienic indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（cfu／g）

依照非無(wú)菌含藥材原粉的中藥制劑的微生物標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)6 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗(yàn)組的微生物限度均符合含生藥粉口服固體制劑衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。綜上分析，并考慮工業(yè)生產(chǎn)中的滅菌成本問(wèn)題，8 kGy 及8 kGy 以上劑量輻照滅菌效果最佳。

表4 不同60Co－γ 射線輻照劑量的蜈蚣藥粉8 種核苷類成分含量測(cè)定結(jié)果（n ＝3）Tab.4 Determination of eight nucleosides in Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（n ＝3）

2.4 化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，不同試驗(yàn)組蜈蚣藥粉中次黃嘌呤和黃嘌呤含量明顯高于其他6 種核苷類成分，15 個(gè)批次樣品中均含有上述8 種成分，各試驗(yàn)組間含量無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；且不同輻照劑量5 個(gè)試驗(yàn)組中，8 種核苷類成分總含量均處于同一水平，且無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)中探討了不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉質(zhì)量的影響，結(jié)果5 個(gè)試驗(yàn)組中蜈蚣藥粉形態(tài)、顏色、氣味均一穩(wěn)定；水分、總灰分、酸不溶性灰分、黃曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金屬及有害元素各指標(biāo)各試驗(yàn)組間均無(wú)顯著差異；5 個(gè)試驗(yàn)組樣品中均含有胞嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脫氧肌苷、胸苷8 種核苷類成分，不同輻照劑量5 個(gè)試驗(yàn)組中8 種核苷類成分總含量均處于同一水平，差異不顯著，表明輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉中活性成分的含量無(wú)影響。

不同劑量60Co－γ 射線輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉中微生物數(shù)量影響極為明顯，各試驗(yàn)組間需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)差異顯著；輻照劑量越高，微生物限度指標(biāo)檢查結(jié)果越低，6 kGy 以上輻照劑量滅菌的試驗(yàn)組微生物限度符合含生藥粉口服固體制劑衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，60Co－γ 射線輻照滅菌對(duì)蜈蚣藥粉綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)中衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)有優(yōu)化提升作用，其他方面品質(zhì)如理化性質(zhì)、成分含量等方面無(wú)顯著影響。因此，60Co－γ射線輻照滅菌可作為蜈蚣藥材的滅菌方法進(jìn)行推廣；在保證滅菌效果符合要求的前提下，綜合工業(yè)生產(chǎn)中滅菌成本及輻照安全性問(wèn)題，在輻照劑量0 ～10 kGy 范圍內(nèi)，8 kGy 及8 kGy 以上劑量輻照滅菌效果最佳。因此，蜈蚣藥材飲片輻照滅菌最佳劑量為8 ～10 kGy。