羅庫溴銨注射液水解降解雜質含量預測研究

付 強，柯 銳，朱柄甲，徐興志，劉君洋，王志云，陸偉躍

（1. 浙江華海藥業股份有限公司，浙江 臺州 317000； 2. 復旦大學藥學院，上海 201303）

羅庫溴銨注射液是荷蘭N.V.Organon 公司開發的全身麻醉輔助用藥，用于常規誘導麻醉期間的氣管插管，以及維持手術中骨骼肌的神經肌肉阻滯，是臨床常用的手術輔助用藥［1］。本研究中將經典恒溫法應用于羅庫溴銨注射液穩定性預測中，評估穩定性試驗中降解雜質增長情況和有效期，以輔助產品開發和申報。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SevenMultiS400 型pH 計（梅特勒－托利多公司）；e2695／2489 型高效液相色譜儀／紫外檢測器（沃特世公司）；XS105DU 型電子分析天平（梅特勒－托利多國際有限公司，精度為十萬分之一）；Million－Reference 型超純水機（默克化工技術有限公司）；DHG－9076A 型恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SHH－220SD 型藥品穩定性試驗箱（重慶永生實驗儀器廠）。

1.2 試藥

羅庫溴銨注射液為實驗室自制，批號為20180501，規格分別為每支50 mg ∶5 mL，100 mg ∶10 mL，于2 ～8 ℃條件下保存。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取5 支注射液，置干燥玻璃器皿中，混勻，精密移取2.0 mL，用乙腈稀釋10 倍，即得供試品溶液，其中活性成分羅庫溴銨的濃度為1.64 mmol／L。

2.2 含量與有關物質分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate? SiO2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；緩沖液：50 mmol／L 四甲基氫氧化銨緩沖液，用磷酸調pH 至7.4；流動相：緩沖液－乙腈（10 ∶90，V／ V）；流速：1.5mL／min；檢測波長：210nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。

2.2.2 含量和有關物質分析

分別采用質量濃度為1.00，0.02 mg／mL 的羅庫溴銨供試品溶液作為對照品溶液，各雜質的相對響應因子以1.00 計算。含量和有關物質分析高效液相色譜法參照2015 年版《中國藥典（二部）》［2］。分離度溶液典型圖譜見圖1。各已知雜質分離度均≥1.5。經方法學考察確認，專屬性良好，線性關系好（R2＝0.999 9），樣品加樣回收率介于99.5% ～101.2%（n ＝6），精密度試驗結果的RSD 為0.90%（n ＝6），均符合要求。

圖1 羅庫溴銨注射液分離度溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the separation solution of Rocuronium Bromide Injection

2.3 加速和影響因素試驗評估

根據國內仿制藥開發和穩定性研究要求，在本品穩定性研究中，對產品性狀、澄清度與顏色、細菌內毒素、可見異物、不溶性微粒、無菌、pH 值、含量、有關物質9個檢測項進行控制。所有檢測項的限度標準均與2015年版《中國藥典（二部）》要求一致。詳見表1。上述任何一個檢測項超出既定控制標準均會導致產品的穩定性超出有效期。

為評估本品穩定性放置過程中各檢測項的超標風險，取樣品，置40 ℃穩定性試驗箱中，分別于放置0，5，10，15，30 d 后取出，按成品穩定性標準進行檢測。結果見表1。隨著在40 ℃條件下放置時間的延長，雜質V 含量從0.39%迅速增加至1.33%，增長明顯，而其他雜質限度均低于限度標準且無超標趨勢。將樣品置60 ℃穩定性試驗箱中，分別于放置0，5，10 d 后取出，雜質V 含量從0.39%迅速增加至3.00%，放置10 d 后明顯超出限度標準（≤2.0%），羅庫溴銨含量從100.4% 降至95.7%，發生明顯變化，但未超出穩定性限度標準。pH 值等其他檢測結果在40 ℃和60 ℃加速試驗條件下，均符合成品穩定性標準且無超標趨勢。表明雜質V 為主要增長的降解雜質，在所有質量控制項目中超標風險最高，故預測雜質V 的含量可推測產品的穩定性和有效期。

2.4 包裝規格與放置方式影響考察

羅庫溴銨注射液中的雜質V 是羅庫溴銨分子中甾體母核17 位乙酸酯水解為羥基的降解產物，該降解反應為典型的水解降解反應，反應速率與溫度的關系符合Arrhenius 方程［4－7］。通過預測該雜質含量可評估產品的雜質增長情況，推測產品的穩定性和有效期。

羅庫溴銨注射液為西林瓶包裝，開發規格為每支50 mg ∶5 mL 或100 mg ∶10 mL，注射液開發中需對每個規格試驗批次進行正置和倒置穩定性研究。為評估包裝規格和正／倒置對雜質V 降解速率的影響，取樣品置（25±2）℃試驗條件，分別于放置0，5，10，15，30 d 后取出，檢測有關物質。正／倒置和不同規格羅庫溴銨注射液的雜質V 增長速率基本一致，且雜質Ⅴ和未知雜質含量也未見明顯差異，表明包裝規格和正／倒置對雜質V 增長速率的影響較小。詳見圖2。

表1 羅庫溴銨注射液40 ℃加速試驗結果Tab.1 Results of the accelerated test of Rocuronium Bromide Injection at 40 ℃

圖2 （25±2）℃長期試驗條件下樣品雜質V 含量Fig.2 The content of impurity V in the sample under the longterm test condition at （25 ±2）℃

2.5 經典恒溫試驗

參照Arrhenius 方程－lnK ＝Ea／R×（1／ T）－lnA。式中，K 為反應速率常數［mol／（L·h）］；A 為頻率因子常數［mol／（L·h）］；Ea 為反應活化能（J／mol）；R 為摩爾氣體常數［8.314 J／（mol·K）］；T 為絕對溫度（K）。

通過測定不同溫度條件下雜質V 的生成速率，求得Arrhenius 方程中的未知數，預測長期穩定條件下的雜質V 含量。取樣品若干支，分別在25 ～71 ℃條件下正置放置720 h 后取出，進行含量和有關物質分析。

2.6 反應速率常數K 值及活化能確定

不同溫度條件下的放置時間和雜質V 含量檢測結果見表2。羅庫溴銨注射液為水溶液注射劑，不同溫度條件下的加速試驗中，活性成分含量在95.8% ～98.8%之間，表明水和羅庫溴銨2 種反應物的濃度變化均很小，生成雜質V 的酯水解反應可近似認為是零級反應，反應符合方程C ＝K t ＋C0。式中，C 為雜質V 的實時濃度；C0為雜質Ⅴ的初始濃度；K 為雜質Ⅴ生成反應的反應速率常數；t 為反應時間。在不同溫度條件下，以雜質V 的濃度C（%）對反應時間t（h）作線性回歸曲線，方程的斜率即為雜質V 的生成速率。由表2 可知，所有線性回歸方程的回歸系數均良好。將表2 中的百分比濃度數值轉換為摩爾濃度數值，以反應速率的負對數（－lnK）對反應溫度的倒數（1／ T）作線性回歸方程，得－lnK ＝9 765.601 74×（1／ T）－24.511 96，R2＝0.999 4，方程的斜率為 E a ／ R，截距為－ ln A。求得 E a 為81 191.2 J／mol，A 為7.25×108mol／（L·h）。

2.7 產品有效期計算

羅庫溴銨注射液長期穩定性儲存條件為（5±3）℃，根據Arrhenius 方程，5℃和8℃長期穩定性儲存條件下，雜質V生成反應速率常數K 分別為4.10×10－7mol／（L·h）和5.96×10－7mol／（L·h）。求得8 ℃最差條件下，雜質V含量達到2015 年版《中國藥典（二部）》規定的限度值（≤2.0%）所需時間至少為60 個月，足夠支持上市產品藥品說明書規定的36 個月有效期。

2.8 預測與實測結果對比

分別選擇3 批每支50 mg ∶5 mL 規格正置生產批次和3 批每支100 mg ∶10 mL 規格倒置生產批次，開展長期穩定性研究。以雜質V 預測增長量或3 批注射液雜質V 平均實測增長量對放置時間作圖。詳見圖3。同一規格生產批次不同放置時間雜質V 含量的實測值標準偏差均≤0.02%，表明不同批次間雜質V 含量差異較小。50mg∶5 mL 規格正置生產批次雜質V 含量從0個月的（0.39±0.02）%增加到長期24 個月的（0.86±0.02）%，平均增加（0.47±0.02）%；100 mg ∶10 mL 規格倒置生產批次雜質V 含量從0 個月的（0.41±0.02）%增加到長期24 個月的（0.88±0.02）%，平均增加（0.47±0.02）%。不同批次間雜質V 增長速率基本一致，增長情況的實測值和預測值基本吻合，表明通過穩定性預測研究評估本品雜質V 的增長情況是可行的。

同時，對生產批次所有檢測項的實測結果進行分析，除雜質V 外的其他檢測項均未發生明顯變化，暫無超標風險。包裝規格和正、倒置對雜質V 的增長速率無明顯影響。表明通過Arrhenius 方程計算雜質V 的增長情況，可以預測羅庫溴銨注射液的有效期，是輔助產品開發和申報的有效數據。

表2 不同溫度條件下雜質V 含量對反應時間的線性回歸方程及反應速率常數Tab.2 The linear regression equation of impurity V content on reaction time and the reaction－rate constant at different temperatures

圖3 （5 ±3）℃長期試驗條件下3 批樣品實測平均值及預測值Fig.3 Measured average values and predicted values of three batches of samples under the long－term test condition at （5 ±3）℃

3 討論

注射液開發通常需要根據原研藥藥品說明書開展為期數年的長期穩定性研究［8］，長期穩定性試驗中任一檢查項結果超出限度標準均會導致產品開發風險，故評估產品的有效期是注射液開發的重點。為降低產品開發和穩定性研究的風險，通常會開展為期5 ～30 d 的影響因素研究，以評估不同處方工藝產品的穩定性差異。但影響因素條件過于劇烈，與產品有效期關聯性較弱，往往需要開展6 ～12 個月的加速試驗，才能更好地評估產品長期儲存條件下的有效期，耗時較長；另外，加速試驗結果超標未必表示長期穩定性試驗失敗。

目前，文獻［9－13］報道了經典恒溫法或初均速加速法在藥品主成分穩定性預測方面的應用，采用Arrhenius方程測定藥品主成分降解反應的活化能，進一步計算長期穩定性條件下的主成分降解情況。經典恒溫法可通過1 個月的加速試驗來預測主成分數年內的降解情況，時間短，可靠性高，缺點在于僅通過預測主成分的降解來評估藥物的有效期，缺乏對藥物雜質降解情況等其他質量控制指標的評估。首先，通過加速試驗評估羅庫溴銨注射液每個穩定性研究檢測項的超標風險，認為羅庫溴銨注射液水解產生的雜質V 增長明顯，超標風險最高，其他控制項目超標風險較低，故對雜質V 含量增長情況的預測可預估產品的有效期。本研究中根據Arrhenius方程設計不同溫度條件下的注射液加速試驗，計算雜質V 生成反應活化能，預測產品長期穩定性條件下的有效期。

加速試驗結果表明，羅庫溴銨注射液雜質V 含量是產品穩定性研究中超標風險最高的指標，預測其含量增長情況可評估產品的有效期。經典恒溫法主要用于預測藥物活性成分的降解速率［8－10］。根據Arrhenius 方程，采用經典恒溫法測定羅庫溴銨注射液中雜質V 的生成反應活化能，預測長期穩定性條件下該雜質的增長情況。通過Arrhenius 方程預測的結果與生產批次長期24個月穩定性實測結果基本一致，包裝規格和正置、倒置對雜質V 的增長速率無明顯影響。表明方法準確、可靠，適用于本品水解降解雜質含量和有效期的預測研究。本方法有望應用于其他符合Arrhenius 方程的水解降解雜質的含量預測研究，以輔助產品的開發和申報。