反相高效液相色譜法測定參芪降糖膠囊中梓醇含量*

馮光軍，羅 丹，冉鳳英，楊 洋，楊光義，梅全喜，陳琴華△

（1. 廣東省深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518101； 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，湖北 十堰 442008）

參芪降糖膠囊是由人參莖葉皂苷、五味子、黃芪、山藥、地黃、覆盆子、麥冬、茯苓、天花粉、澤瀉、枸杞子11 味中藥材組方的復(fù)方制劑［1］，具有益氣養(yǎng)陰、滋脾補(bǔ)腎功效，主要用于治療消渴癥及2 型糖尿病。現(xiàn)代研究表明，參芪降糖膠囊能降低糖尿病周圍神經(jīng)病變患者血清內(nèi)皮素1（ET－1）、白細(xì)胞介素6（IL－6）及腫瘤壞死因子－α（TNF－α）水平，療效顯著［2－4］，能顯著降低血糖，調(diào)節(jié)血脂水平，預(yù)防糖耐量異常向糖尿病轉(zhuǎn)化［5－8］。目前對(duì)參芪降糖膠囊的質(zhì)量控制主要針對(duì)人參和黃芪的活性成分，采用薄層色譜法和高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行含量測定［9］。地黃為常用補(bǔ)益中藥，具有調(diào)節(jié)心血管、免疫、中樞等系統(tǒng)功能，以及降糖、降壓等生物活性［10－11］。以梓醇為代表的環(huán)烯醚萜苷類是地黃最主要的活性成分，具有降血糖、利尿、緩和瀉下等作用［12－13］，同為參芪降糖膠囊的主要有效成分。本研究中建立了梓醇的含量測定方法，為參芪降糖膠囊的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC－9A 型高效液相色譜儀（日本島津有限公司），配有紫外檢測器和浙江大學(xué)開發(fā)的N2000 型色譜工作站；KQ－100DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；AEU－210 型電子天平（日本島津有限公司，精度為百萬分之一）。

1.2 試藥

梓醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110808－201711，規(guī)格為每瓶20 mg，純度≥98%，供含量測定用）；參芪降糖膠囊（五O 五藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為1712025，1805102，1808065，規(guī)格為每粒0.35 g）；乙腈（色譜純，十堰市化學(xué)試劑廠）；水為微孔濾膜過濾純化水，其余試劑均為分析純。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Linksil HPLC Column ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%磷酸溶液（2 ∶98，V／ V）；流速：0.8 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取梓醇對(duì)照品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇，超聲溶解，并用甲醇定容，制成含梓醇100 μg／mL的對(duì)照品溶液。取樣品10 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取2.5 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺地黃的陰性對(duì)照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。色譜圖見圖1。結(jié)果理論板數(shù)按梓醇峰計(jì)均大于9 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液（100 μg／mL）適量，置10 mL 容量瓶中，以甲醇定容，分別制成含梓醇質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50，100 μg／mL的系列對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝7 170 X－7 671，R2＝0.998 1（n ＝6）。結(jié)果表明，梓醇質(zhì)量濃度在1 ～100 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：吸取梓醇對(duì)照品溶液（20 μg／mL），按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為0.98%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1805102）適量，研細(xì)，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為1.02%（n ＝6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1805102）適量，研細(xì)，依法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為110 μg／g，RSD 為1.96%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1805102，梓醇含量為110 μg／g）1.0 g，研細(xì)，精密稱定，依法制備供試品溶液6 份，各加入梓醇對(duì)照品溶液（100 μg／mL）1 mL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Reuslts of the recovery test（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號(hào)分別為1712025，1805102，1808065）樣品，取出內(nèi)容物，研細(xì)，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL。結(jié)果3 批樣品中梓醇含量分別為110，105，108 μg／g。

3 討論

本試驗(yàn)中采用反相高效液相色譜法測定參芪降糖膠囊中梓醇的含量，前期處理簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。對(duì)梓醇對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長掃描，最大波長為205 nm。考察了甲醇－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈－0.1%磷酸溶液（2 ∶98，V／ V）為流動(dòng)相時(shí)，梓醇與其他成分分離良好，保留時(shí)間適中。考察了水－甲醇、甲醇、乙醇超聲提取對(duì)梓醇含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用甲醇超聲提取，樣品雜質(zhì)量少，提取效率較高，故選擇甲醇為提取溶劑。考察了超聲提取時(shí)間，結(jié)果超聲提取30 min 后，提取效率并未提高，故選擇甲醇超聲提取30 min。

本研究結(jié)果表明，本方法分離效果和重復(fù)性均良好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，可用于參芪降糖膠囊中梓醇的含量測定。