基于網絡藥理學分析“茯苓-澤瀉”治療前列腺炎作用機理研究

★嚴張仁 潘俊卿 胡香君 張思娜 申淑嫻 王萬春

（1江西中醫藥大學附屬醫院中醫外科 南昌 330006；2.江西中醫藥大學研究生院 南昌 330004）

前列腺炎（prostatitis）是前列腺在病原體或（和）某些非感染因素作用下，出現以骨盆區域疼痛或不適、排尿異常等癥狀為特征的一組疾病，好發于成年男性各年齡段，全球發病率高達10 %～15 %［1］。美國國立衛生研究院（NIH）根據臨床表現將其分為：Ⅰ型:急性細菌性前列腺炎（ABP）；Ⅱ型:慢性細菌型前列腺炎（CBP）；Ⅲ型:慢性前列腺炎/慢性骨盆綜合征（CP/CPPS）；Ⅳ型:無癥狀型前列腺炎（AIP）［2］。病原體感染是Ⅰ、Ⅱ型前列腺炎主要致病因素；Ⅲ型前列腺炎病因發病機制尚不明確但可能與病原體感染、排尿功能異常、神經內分泌失調、免疫反應異常及氧化應激等因素相關［3］。前列腺炎根據分型可選擇采用抗生素、α受體阻滯劑、非甾體抗炎鎮痛藥等對癥治療和支持治療，但治療周期較長，臨床療效欠佳，特別是Ⅱ、Ⅲ型前列腺炎，病情遷延難愈，反復發作，常伴有性功能障礙，焦慮，抑郁等癥狀，嚴重影響患者身心健康和生活質量。

前列腺炎屬中醫“精濁”“淋證”和“白濁”等范疇，中醫藥治療前列腺炎經歷代醫家不斷的臨床實踐，對本病診治提供了豐富的經驗，積累了眾多療效明確的中藥、方劑，如前列腺湯、解毒活血湯等。茯苓，味甘，淡，性平，歸心、肺、脾、腎經，具有利水滲濕，健脾，寧心的功效；澤瀉，味甘，淡，性寒，歸腎、膀胱經，具有利水滲濕，泄熱，化濁降脂的功效。《傷寒論》中五苓散、豬苓湯、腎氣丸、茯苓澤瀉湯等方劑常使用茯苓、澤瀉相須配伍主治小便不利，淋證等前列腺疾病［4］。閔杰等［5］和孟明洋等［6］對中醫藥治療前列腺炎文獻挖掘發現“茯苓-澤瀉”藥對使用頻次較高。目前中醫藥防治前列腺炎研究多集中在炎癥代謝通路實驗研究領域，而針對前列腺炎復雜的發病機制，缺乏利用基因組學、蛋白組學和網絡藥理學等新技術、新手段綜合探討中醫藥治療前列腺的相關機制研究［7］。本研究基于文獻挖掘的基礎上采用網絡藥理學探索“茯苓-澤瀉”藥對活性成分及藥效作用機制對前列腺炎的整體治療，分析“茯苓-澤瀉”多成分、多靶點、多通路的協同調控前列腺炎相關病理生理功能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及潛在靶點檢索與篩選 在ETCM（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/）數據庫數據庫中分別檢索“茯苓”“澤瀉”中包含的化合物及化合物對應的潛在靶點，并選取Druglikeness Weight≥0.3的化合物作為藥物活性成分。ETCM中化合物的類藥性評價采用的是Bickerton團隊于2012年發表于Nature Chemistry的算法。靶標預測采用的是MedChemStudio（3.0版）軟件。MedChemStudio是藥物相似性搜索軟件，用于查找與中藥成分具有高度結構相似性（Tanimoto＞0.8）的已知藥物，從而進行靶標預測［8］。

1.2 疾病相關靶點檢索 以“prostatitis”為關鍵 詞,分 別 在GeneCard（https://www.genecards.org/)、CTD(http://www.ctdbase.org/）數 據 庫 選 取Score≥30的靶點作為前列腺炎潛在作用靶點，去除重復后并使用Uniprot數據庫（http://uniprot.org）中UniprotKB功能,物種設置為human,對篩選的靶點蛋白及基因進行校正得到疾病靶點Genesymbol。

1.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建與分析 采用在線繪圖Omishare Tools平臺（http://www.omicshare.com/tools/）獲得“茯苓-澤瀉”藥對與前列腺炎共同靶點及Venn圖。共同靶點信息借助Cytoscape3.7.1軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡模型并使用Network Analyzer插件對網絡進行分析。

1.4 共同靶點功能分析 為明確共同靶點之間的相互作用，將共同靶點導入String(http://string-db.org/)數據庫中進行蛋白相互作用（protein-protein interaction network,PPI network）網絡分析,并將PPI網絡分析結果導入Cytoscape3.7.1軟件中構建PPI網絡并使用Network Analyzer插件對網絡進行網絡拓撲學分析，在DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中對共同靶點進行GO（Gene Ontology） 及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通 路 富 集 分 析，選 取P＜0.05且FDR＜0.05作為顯著功能與通路的臨界值，在Omishare Tools平臺繪制排名前20的KEGG通路氣泡圖，并將排名前20的GO分析中生物學過程按PValue值大小列出。

2 結果

2.1 藥物活性成分及潛在靶點、疾病相關靶點 從ETCM數據庫中篩選出茯苓活性成分31個，預測靶點231個；澤瀉活性成分22個，預測靶點251個。檢索出疾病相關靶點633個。茯苓-澤瀉藥對與前列腺炎同有靶點22個，茯苓對前列腺炎特有調控靶點13個；澤瀉對前列腺炎特有調控靶點28個。詳見圖1和表1。

圖1 “茯苓-澤瀉”藥對與前列腺炎靶點交集Venn圖

表1 “茯苓-澤瀉”藥對與前列腺炎靶點交集

2.2 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建與分析 運用Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡，如圖2，共得到119個節點，590條邊，53個中藥活性成分，共同參與調節63個前列腺炎相關靶點。網絡節點平均連接度為9.916，中位數為7，定義網絡中連接度大于或等于10 的節點為網絡核心節點，核心節點在網絡中關聯性強，具有更大的影響，在網絡中更重要。核心成分節點33個，茯苓24個，澤瀉8個；核心靶點節點15個。連接度最高活性成分的前5個為13?’,17?’-epoxyalisol A、dehydroeburicoic acid、eburicoic acid、3?’-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、trametenolic acid、dehydroabietic acid methyl ester，說明這些成分可以同時調控較多的靶點，可能在藥物治療疾病中發揮較高的作用；核心靶點節點前10為NR3C1，AR，HSD3B1，PGR，VDR，ESR1，NCOA1，RXRA，HDAC2，COX5B，說明這些靶點可能受到藥物作用較強，在藥物治療疾病中更突出。

從圖2總體可以看出，茯苓-澤瀉通過多種活性成分，共同調節多個多疾病相關靶點發揮藥效作用。

圖2 茯苓-澤瀉藥物成分-靶點-疾病網絡圖（箭頭表示靶點，紅色為藥對共同靶點，綠色箭頭為澤瀉特有調控靶點，紫色箭頭為茯苓特有調控靶點；矩形表示活性成分；節點大小與連接度成正比）

2.3 共同靶點功能分析 對63個共同靶點進行PPI網絡構建，有62個共同靶點之間相互關聯存在互作關系，共583條邊，平均連接度為18.806，表明共同靶點之間通過583個相互作用關系緊密相互作用調控62個疾病靶。PPI網絡分析提示AKT1、STAT3、ESR1、CASP3、CCND1、AR、SRC、TNF、MDM2、PTGS2等靶點相互作用更強，可能是發揮治療作用的重要靶點，而TNF、PTGS2是炎癥通路中重要的靶點之一，見圖3。

對63個共同靶點進行GO功能分析及KEGG富集分析,得到生物過程（biological proces，BP）12個、細胞組分（cellular component，CC）1個，分子功能（molecular function，MF）6個，KEGG信號通路39條，排名前30條通路，見圖4。共同靶點功能分析結果顯示共同靶點主要GO分析涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶II轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結合、RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始，RNA聚合酶II的轉錄與翻譯是疾病基因表達的重要生物學過程。KEGG功能分析涉及前列腺癌、PI3K-Akt信號通路、細胞周期、P53信號通路、生成信號通路、EB病毒感染等，其中腫瘤壞死因子信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡等信號通路在炎癥中發揮重要作用。由此看出，茯苓-澤瀉可以通過調節多個生物途徑，多個生物信號通路發揮治療前列腺炎的作用機制。

圖3 共同靶點蛋白-蛋白相互作用網絡（黃色圓圈表示連接度Degree≥20的節點，節點大小與連接度成正比）

圖4 共同靶點GO分析和KEGG富集分析前30氣泡圖

3 討論

細菌性前列腺炎是在機體抵抗力降低時病原體，尤其是革蘭陰性菌中大腸埃希菌感染腺體，引起前列腺組織出現充血、水腫，腺泡或間質內出現大量中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞的浸潤，甚至形成小膿腫，進而出現泌尿系感染等癥狀［9］。非細菌性前列腺炎尤其是Ⅲ型前列腺病因病機尚不明確，目前認為：（1）排尿功能異常：尿液反流使尿液中尿酸、肌酐等刺激前列腺誘發疼痛，且尿酸沉積導致前列腺組織炎癥［10］；（2）免疫功能失調：免疫抑制細胞功能降低，促炎及抗炎介質失衡，尤其是Th1/Th2細胞、Th17/Treg細胞比例失衡［11-12］；（3）氧化應激：氧自由基持續作用導致前列腺發生缺氧，導致水腫及纖維化或支配前列腺的神經受損［13］；（4）神經內分泌紊亂：疼痛物質P、神經生長因子（nerver growth factor，NGF）等細胞因子誘導膠質細胞介導L5-S2節段脊髓神經功能障礙［13］；（5）其他，骨盆相關疾病、精神心理因素均與前列腺炎發生相關。目前針對前列腺炎的治療十分局限且療效一般，發現具有靶向性的活性成分是精準治療前列腺炎的新方向。

本研究篩選的茯苓主要成分為茯苓酸，三萜類成分。研究表明茯苓三萜化合物具有利尿作用［14］，因而減輕前列腺炎排尿異常反應，茯苓三萜成分對急、慢性炎癥均有抑制作用［15］。茯苓辛酸C對巨噬細胞產生NO的抑制作用并通過下調核因子NF-κB來抑制iNOS和COX-2表達從而發揮抗炎作用［16］。茯苓酸通過減弱白細胞與微血管內皮細胞間的黏附,抑制腸黏膜微血管內皮細胞的過量分泌,阻止過多白細胞到達炎癥部位和過度炎癥反應,發揮抗炎作用［17］；茯苓酸是一種新的拓撲異構酶抑制劑，能有效抑制DNA聚合酶的活性，使細胞停留在G1期，抑制細胞水腫及纖維化［18］。三萜類成分也是澤瀉發揮藥理活性的主要成分，具有抗炎、抗菌、利尿等作用［19］。本研究篩選出三萜類13個，倍半萜5個，澤瀉主要通過三萜類和倍半萜發揮成分發揮治療作用。澤瀉三萜能抑制toll樣受體4（TLR4）/NADPH氧化酶2（NOX2）信號通路發揮抗炎作用［20］；Alisol B 23-acetate作用PI3K-AKT信號通路［21］。澤瀉總三萜可以減少炎癥介質的釋放，抑制急性炎癥對炎癥造成的組織增生有抑制作用［22］。因此，茯苓-澤瀉藥對主要通過茯苓三萜類成分，澤瀉三萜類和澤瀉倍半萜成分發揮治療前列腺炎的作用。

中藥治療疾病具有多成分-多靶點-多通路的特點，靶點之間相互作用，組成復雜的網絡調控體系。共同靶點PPI分析，生物功能分析和通路富集結果顯示AKT1、STAT3、ESR1、TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、HIF1A、MAPK14、PIK3CA、IL1B等是關鍵靶點；蛋白激酶活性、一氧化氮生物合成過程的正調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄起始，正負調控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等是關鍵的生物學過程；前列腺癌、PI3KAkt信號通路、細胞周期、p53信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、FOxO信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路是關鍵的信號通絡。MAPK14在由促炎細胞因子或者物理刺激等細胞外刺激所引發的細胞級聯反應中起重要作用；TNF、IL1B是一些炎癥病理生理反應最重要的調節因子；PTGS2在機體炎癥反應過程中起著十分重要的作用，主要功能之一就是催化花生四烯酸產生前列腺素E2，廣泛參與機體多個組織和器官的炎癥反應。TNF、Toll樣受體信號通路信號通路與炎癥免疫調控，氧化損傷相關［23］；HIF-1 信號通路在炎癥因子調控及低氧濃度或缺氧應答中發揮重要作用的；PI3K-AKT信號通路在某些病毒復制過程中必須激活。本研究結果表明，茯苓-澤瀉可能作用于TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、MAPK14等的多個靶點，作用于PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、FOxO信號通路、HIF-1信號通路TNF、等多個信號通路，調控RNA聚合酶II啟動子轉錄起始，正負調控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性治療前列腺炎。

綜上所述，“茯苓-澤瀉”藥對相須配伍，主要通多其三萜類成分調節TNF、PTGS、NFKB1、MAPK14等靶點，促進RNA聚合酶II啟動子轉錄起始，正負調控，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，調控PI3K-Akt、TNF、HIF-1、Toll樣受體信號通路等參與組織的抗炎、氧化應激等生物學修復過程。茯苓-澤瀉多成分，共同參與調節到前列腺的多個相關靶點中，協同參與相關信號通路綜合改善前列腺的病理生理過程。值得注意的是目前中藥主要成分提取及其類藥性研究仍然不足，重要成分靶點多建立在計算機模擬預測和既有藥物研究基礎上的比對，預測靶點在疾病中發揮的機制仍需基礎研究來驗證。因此，本研究仍需進一步的中藥藥理實驗研究加以驗證。