基于單細胞RNA測序探討膀胱癌患者外周血單個核細胞特征的研究*

包夢穎，曾燕玉，代 艷，黃 榮，毛星寧，顏赟坤，張慶云，郭冰倩，葉 雨，莫曾南△

（廣西醫科大學 1.基因組與個體化醫學研究中心；2.廣西生物醫藥協同創新中心廣西－東盟重大疾病防治協同創新中心；3.廣西基因組與個體化醫學研究重點實驗室；4.廣西基因組與個體化醫學研究協同創新中心，南寧 530021；5.廣西醫科大學第二附屬醫院，南寧 530000；6.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧 530021）

膀胱癌是第五大常見的腫瘤，全球每年有超過43萬名患者被診斷為膀胱癌[1]。目前許多基因表達譜的研究是針對來自患者或健康人的活檢組織，在取材的過程中具有一定的損傷性。由于外周血取材簡單且不具有侵入性的損傷，因此外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）已經成為了研究基因表達譜的重要樣本來源[2-4]。目前已有研究發現術前中性粒細胞與淋巴細胞比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）升高可預示可手術切除的泌尿系腫瘤（包括膀胱癌）預后較差[5]，這說明外周血在一定程度上能夠反映膀胱癌患者手術治療后的預后情況。但膀胱癌外周血的特征差異方面的研究較為欠缺。

單細胞RNA 測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術是對單個細胞進行RNA 測序，能夠在單細胞分辨率下生成單個細胞的獨特的轉錄組并建立基因調控網絡[6]。這項技術已經在腫瘤免疫微環境[7-8]和細胞異質性[9-10]研究方面得到廣泛應用。Luo等[11]對終末期腎臟疾病患者的PBMC進行scRNA-seq 技術研究，繪制了單細胞圖譜發現了8種新的細胞類型和揭示了細胞間的異質性，并找到了驅動終末期腎病的關鍵因素。

本研究的主要目的是基于scRNA-seq技術對膀胱癌患者與健康人中PBMC進行分群，比較膀胱癌患者與健康人的PBMC中的特點和組成差異，為進一步研究膀胱癌患者PBMC 提供了一個新的研究方案。

1 材料和方法

1.1 一般資料

為了反映健康人的普遍情況和腫瘤病人個體特征，收取2019 年11 月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院經診斷為膀胱癌患者的術前肝素鈉抗凝外周血1例和收取3位健康人空腹肝素鈉抗凝外周血。

膀胱癌患者納入排除標準：（1）泌尿系彩超，CT，膀胱鏡檢，病理活檢結果術前診斷為膀胱尿路上皮癌；（2）術后病理診斷為尿路上皮癌。排除標準：（1）術前接受過放化療治療；（2）患者有自身免疫性疾病，或腎功能不全等疾病。

健康人納入排除標準：（1）年齡在55～75歲；（2）既往未合并高血壓、糖尿病、痛風、自身免疫性疾病、肝腎功能不全、傳染性疾病、高類固醇血癥和腫瘤疾病。

本研究中研究患者為男性，64 歲，病理結果診斷為膀胱尿路上皮癌T2aN0M0。健康人分別是男性，59歲；男性，68歲；女性，68歲。本研究通過了廣西醫科大學醫學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑、儀器和分析軟件

1.2.1 試劑和儀器 人PBMC 分離液購于北京索萊寶科技有限公司；杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）購于加拿大維森特公司；紅細胞裂解液購于美國Bio-Legend 公司；臺盼藍購于美國Gibco 公司。水平離心機購于湘儀離心機儀器有限公司；單細胞油包水制備和轉錄組文庫構建試劑盒（Chromium Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3、Chromium Chip B Single Cell Kit 和Chromium i7 Multiplex Kit）、Chromium Single Cell Controller 購于美國10X Genomics公司。

1.2.2 分析軟件 Cell ranger（version 3.1.0），R 語言（version 3.5.1），Rstudio，單細胞RNA測序數據分析Seurat包。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC 制備 按照1∶1 比例用DPBS 稀釋肝素鈉抗凝血。按照分離液和血液2∶1的比例將稀釋后的血液緩慢滴加至人PBMC 分離液液面上。500 g，無剎車離心25 min。吸出離心后分離出的白膜層，用5倍的DPBS清洗后，350 g，離心5 min收集細胞。加入5 mL 紅細胞裂解液裂解10 min 后加入等量的DPBS 混勻后，350 g，離心5 min。棄去上清后，用DPBS 清洗一遍后，再加入適當體積的DPBS重懸，臺盼藍染色鏡檢計數和計算細胞活率，要求細胞活率大于80%。

1.3.2 PBMC 單細胞RNA 測序 采用基于液滴的scRNA-seq 平臺，按照10X Genomics Single Cell 3'v3試劑盒的說明書中的實驗步驟進行油包水與文庫制備。其中1位膀胱癌患者的PBMC作為一例樣本上機，健康人PBMC 的樣本是由3 個健康人的PBMC懸液等比例均勻混合成一例PBMC的樣本上機。在芯片上分別加入樣本（每個樣本加載細胞數為22 000 個），Master Mix,Gel Beads 和Partitioning Oil，在Chromium Single Cell Controller 儀器中形成油包水GEMs (Gel Bead-in-Emulsions)。再進行細胞裂解與RNA 逆轉錄后，將cDNA 進行擴增純化，片段化，加接頭和Index 構建文庫，最后用illumina測序儀進行測序。

1.4 單細胞RNA測序數據分析

1.4.1 原始數據處理和數據質控 首先將測序產生的原始數據轉換成Fastq文件，并比對人類基因組序列對數據進行初步處理。然后用Cell Ranger V3.1.0對數據進行初步質控和生成生成基因表達矩陣(matrix.mtx.gz)，基因表(genes.tsv.gz)和細胞條形碼表(barcodes.tsv.gz) 文件。然后使用R3.5.1 和Seurat3.1.1 對數據進一步處理，過濾排除掉線粒體基因比例較高的細胞，通過設定閾值，過濾掉基因數小于200 或大于3 000 以及線粒體基因比例大于10%的低質量細胞。然后將不同細胞之間變異差異系數較大的1 500個基因挑選出進行后續的分析。

1.4.2 降維聚類和細胞注釋 根據MergeSeurat 功能將健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 這兩例數據整合在一起，運行主成分（principal component，PC）分析，用ElbowPlot 函數繪制所有PC 的分布點圖，取拐點處對應的PC作為dim值。選擇合適的分辨率，用FindClusters 功能將細胞聚類。接下來，使用FindAllMarkers功能來查找每種類型細胞之間的差異基因。根據細胞差異基因和細胞類群特征基因的表達對細胞進行注釋。

2 結果

2.1 單細胞測序分析膀胱癌外周血轉錄組特異性的流程

為了繪制膀胱癌患者和健康人PBMC 單細胞圖譜，探究PBMC細胞亞群之間的差異特征和發現特異類群。從1例膀胱癌確診患者的術前外周血和3 位健康人的外周血中分離出單個核細胞，制成PBMC 懸液，利用10X Genomics 單細胞RNA 測序平臺進行單細胞RNA測序，得到了1例膀胱癌患者和1例健康人的PBMC數據。利用Cell Ranger對原始數據進行初步處理，從健康人的PBMC數據中獲得了11 602 個細胞，膀胱癌患者PBMC 中獲得了9 480 個細胞。再用R3.5.1 和Seurat3.1.0 對處理后的數據進一步分析過濾掉低質量的細胞后進行后續的生物信息學分析，見圖1。

2.2 健康人和膀胱癌患者PBMC scRNA-seq 數據分析

首先分別比較健康人和膀胱癌患者PBMC 單細胞測序數據中每個細胞的基因數、count 數、線粒體分布和血紅蛋白基因分布情況（圖2A、圖2B），以及計算出每個細胞count 數分別與線粒體基因占比、基因數之間的關系（圖2C、圖2D）。根據圖中的基因數和線粒體數分別設置過濾參數，設定閾值，過濾掉基因數小于200 或大于3 000 以及線粒體基因比例大于10%的低質量細胞。過濾掉低質量數據后得到來自健康人PBMC的7 523個細胞和來自膀胱癌患者PBMC的5 289個細胞。

2.3 健康人和膀胱癌患者PBMC 單細胞圖譜聚類結果

隨后使用Seurat 包中的MergeSeurat 函數將過濾掉低質量數據后的健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC數據整合在一起，應用PC分析和基因表達的相似性評估，利用FindClusters功能，將PC分布中的拐點值20作為dim值，分辨率設置為0.28，最終整合后的PBMC 被細分為15 群（圖3A、圖3C）。健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 有很強的重合性，基本每個類群的細胞在兩例PBMC數據中均能找到，僅第11群主要來自膀胱癌患者（圖3B）。

圖1 膀胱癌患者和健康人PBMC提取和單細胞RNA測序流程圖

圖2 健康人和膀胱癌患者PBMC數據質控

圖3 健康人和膀胱癌患者PBMC的UMAP聚類圖

根據每個亞群特征基因表達情況來對各亞群進行注釋命名（圖4A，表1），從整合后的外周血數據中鑒定出了T細胞、NK細胞、B細胞、髓系細胞和血小板。根據CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8A和CD8B基因的表達情況發現T細胞被分成了7群，并且鑒定出0、6、12 群為CD8+T 細胞，2、4、8、13 群為CD4+T 細胞（圖4B）。根據T 細胞不同功能狀態的特征基因的表達（表1），分別定義出初始T 細胞（na?ve T cells）、效應性T細胞（effector T cells）、細胞毒性T 細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）、中央記憶性T細胞（central memory T cells）、效應記憶性T 細胞（effector memory T cells）和調節性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）。

根據自然殺傷（natural killer，NK）細胞的特征基因NCAM1(CD56)、FCGR3A(CD16)、NKG7的表達，將1、3群定義為NK細胞（圖4B）。第14群既表達NK 細胞基因又表達T 細胞基因，同時特異表達增殖性基因MKI67和TUBB（圖4A），將其定義為增殖性的NKT 細胞（proliferative NKT cells）。同時也發現了7、10、11 這三個亞髓系細胞群，分別是經典單核細胞（classical monocytes）、非經典單核細胞（non-classical monocytes）和粒細胞（granulocytes），見表1。

2.4 各類型細胞在外周血中分布和特征

在整合后的PBMC 數據中，T 細胞占細胞總數的50%以上，其中CD4+T 細胞和CD8+T 細胞各占一半。NK 細胞占細胞總數的26%，髓系細胞占7.5%，B細胞占6.4%，血小板占1.9%（圖5A左）。同時發現占比最多的細胞亞群是CD8+效應性T 細胞（19.6%），最少的細胞亞群是增殖性的NKT 細胞（0.4%）。

接著分別對膀胱癌患者和健康人的PBMC 中各個亞群細胞分布進行研究（圖5A右）。對比發現健康人PBMC 中CD8+T 細胞占比更多（占比31.6%），特別是CD8+效應性T 細胞（占比24.2%）。而CD4+T細胞在膀胱癌患者PBMC中占比更多，尤其是CD4+記憶性T細胞，CD4+初始T細胞和Treg細胞在患者PBMC 中占比顯著高于健康人。特別是發現膀胱癌患者和健康人PBMC 中的髓系細胞類群也有較大的差異，健康人PBMC中經典單核細胞和非經典單核細胞均多于膀胱癌患者，但粒細胞幾乎完全來源于在膀胱癌患者。

通過研究健康人和膀胱癌患者PBMC 中CD8+效應性T細胞的基因的相關性，發現患者的CD8+效應性T 細胞和健康人CD8+效應性T 細胞的基因具有很強的相關性。不同的是膀胱癌患者中高表達DUSP2、CXCR4等基因，而健康人高表達GNLY、IFITM2、IL7R和S100B(圖5B)，這提示著健康人PBMC中的效應性T細胞可能具有更強的殺傷功能。

圖4 特征基因在各類群細胞的表達情況展示

表1 各個類群定義細胞類型的特征基因

圖5 各細胞亞群在外周血中的占比

3 討論

膀胱癌是較為常見的泌尿系統腫瘤，具有易復發和預后較差的特點[16]。目前有關膀胱癌患者的外周血方面的研究并不是很多。之前有人對淺表非侵襲性和侵襲性尿路上皮癌患者的外周血中的髓系細胞進行研究[17]，他們在膀胱癌患者的PBMC 中發現了粒細胞型和單核細胞型這兩類髓樣細胞亞群。Audenet 等[18]發現高危非肌層浸潤型膀胱癌（Non-muscle Invasive Bladder Cancer，NMIBC）患者的PBMC的免疫表型與健康人的有顯著差異，但是這項研究主要對PBMC中的T細胞和NK細胞進行比較分析，發現NMIBC患者中NK細胞的數量會顯著高于健康人。以上研究主要基于流式細胞術探討已知細胞標志的類群，并且其結果與筆者scRNAseq結果有一定相似性。流式細胞術是利用已知的抗體標記細胞，其參數有限，并且熒光通道間會有干擾，因此流式細胞術不利于發現罕見的或者新的細胞類群，對目的細胞的其他特點無法進一步探索，更無法研究細胞間的異質性。而scRNA-seq 是在單細胞水平上同時表征數千個細胞基因表達譜的最新方法[19]，能夠無偏倚的揭示每個細胞的基因表達譜，揭示每個細胞特點和特異的基因結構，是發現新的免疫細胞群體和細胞間異質性的好方法。

本研究利用scRNA-seq技術的優勢對健康人和膀胱癌患者的PBMC做細致分群，比較來自不同樣本的各細胞亞群。結果顯示，筆者將健康人和膀胱癌患者的PBMC細分了15群，其中包括3個CD8+T細胞亞群，4 個CD4+T 細胞亞群。本研究還發現膀胱癌患者PBMC 中以CD4+T 細胞為主，CD4+Treg細胞比率較健康人顯著增高。而CD8+T 細胞較健康人相比顯著減少，尤其是具有殺傷功能的效應性T 細胞，同時健康人CD8+效應性T 細胞中高表達顆粒溶素GNLY基因，提示著具有更強的殺傷性。以上這些結果表明膀胱癌患者中機體抗腫瘤免疫反應受到抑制，可能與膀胱癌患者免疫功能低下以及跟腫瘤發生發展有密切關系。特別是筆者在膀胱癌患者的PBMC中發現了粒細胞，這一結果與Eruslanov 等[17]發現膀胱癌患者中循環的粒細胞數量明顯增加的結果相一致。

綜上所述，本實驗結果與利用流式細胞術對PBMC的研究和既往對膀胱癌病人PBMC相關研究發現相吻合且有新的發現，由此可以說明本研究利用scRNA-seq 技術成功建立了研究膀胱癌病人PBMC 的特征的方法，也為后續進一步研究膀胱癌患者PBMC 的特征奠定了研究基礎和提供了一定的參考依據。但本研究也具有一定的局限性，由于研究的樣本量太少，發現的結果僅具有一定的提示性，不具有統計學意義，因此需要擴大樣本量進一步驗證。