HMGB1介導線粒體自噬參與糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷*

吳云嬌，黃 鋒，盧創宏，吳曉丹，曾志羽

（廣西醫科大學第一附屬醫院 1.心血管內科；2.廣西心腦血管疾病防治精準醫學重點實驗室；3.廣西心腦血管疾病臨床醫學研究中心，南寧 530021）

心血管疾病（CVD）在我國的發病率和病死率不斷上升，每年約有300 萬人死于CVD，占中國死亡人數的40%[1]。缺血性心肌病（IHD）作為CVD的重要組成部分之一，已成為主要死亡原因之一。及時恢復血流進行再灌注是治療心肌缺血的主要方式，然而隨之而來的再灌注損傷會導致心肌發生功能紊亂和結構損傷。糖尿病作為CVD 的主要獨立危險因素，和非糖尿病人群相比，糖尿病患者發生IHD的患病率和風險均顯著升高[2]。中國更是全世界糖尿病患者最多的國家，2013年的調查顯示患病人數已達到1.14 億，約占總人口的11%[3]。而糖尿病讓心肌對缺血/再灌注（I/R）損傷的易損性增加[4]，糖尿病急性心梗患者接受再灌注治療后不良事件發生率較非糖尿病患者明顯增高[5]。

生理條件下，線粒體可被特異性包裹于自噬小體，經溶酶體融合后降解、消化，即線粒體自噬，該途徑可消除受損或者過多的線粒體，從而維持細胞內環境的穩定。然而過度的線粒體自噬會使得線粒體的絕對數量減少，進而加劇細胞損傷[6]。缺血過程中增強的自噬往往起到保護作用，但在再灌注過程中過度的自噬會加重損傷[7]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）對細胞自噬和線粒體自噬起重要調控作用[8-9]。HMGB1 參與糖尿病心肌病的發生、發展過程[10-11]，其通過與糖基化終產物受體（RAGE）結合，加重心肌損傷，在糖尿病I/R后心肌重塑中起重要作用[12]。因此，本研究通過使用HMGB1 中和抗體干預糖尿病心肌I/R 小鼠，觀察小鼠心肌組織中線粒體自噬水平，探索HMGB1 是否通過線粒體自噬途徑參與糖尿病小鼠I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性db/db 小鼠43 只，7 周齡，體重35～40 g，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。MiniVent 845 型動物呼吸機（Harvard 公司，美國）；HMGB1中和抗體及Ig-Y空載抗體（Shino test公司，日本）；阿佛丁（南京愛貝生物科技有限公司，中國）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（Sigma 公司，美國)；伊文思藍（Evans blue）溶液（Sigma 公司，美國）；HMGB1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（IBL公司，美國）；肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA試劑盒（武漢華美，中國）；乳酸脫氫酶（LDH）ELISA 試劑盒（武漢華美，中國）；RIPA裂解液、BCA 試劑盒、4×上樣緩沖液（Solarbio 公司，中國）；兔抗HMGB1單克隆抗體（#HM-901）購于美國IBL 公司；兔抗LC3B 多克隆抗體(#ab51520)、兔抗P62單克隆抗體（#ab240635）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（#ab6721）均購于美國Abcam公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體（#10494-1-AP）購于中國Proteintech 公司；兔抗HSP60 單克隆抗體（#GB11243）、Alexa Fluor488 標記山羊抗兔（HRP）IgG（#GB25303）、CY3 標記山羊抗兔（HRP）Ig G（#GB23303）均購于中國servicebio公司。

1.2 心肌I/R 小鼠模型的建立 用1.25%阿佛丁（240 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，固定于小動物手術臺上，行氣管插管，連接呼吸機（潮氣量250 mL/min；呼吸頻率120次/min）。酒精消毒后，沿小鼠左側胸大肌下緣作一斜向上的斜行皮膚切口，逐層鈍性分離肌層，暴露肋間隙。在第4 或第5 肋間隙處打開胸腔，開胸器固定后，剝離心包膜充分暴露左心耳及左心室。在左心耳下緣約2 mm處，用7-0無損傷縫合針線穿過心肌表層，于肺動脈圓錐附近出針，結扎冠狀動脈左前降支（LAD）缺血30 min 后，松開結扎線恢復血流再灌注3 h。左室前壁心肌顏色變蒼白或紫紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高視為缺血成功；開放LAD后左室前壁心肌顏色逐漸恢復紅色視為再灌注成功。

1.3 實驗分組與給藥 將40 只雄性db/db 小鼠隨機分為4組，每組10只。另取3只雄性db/db小鼠加入假手術－生理鹽水（Sham-NC）組。（1）假手術－空載抗體（Sham-G）組：只穿線不結扎LAD，1 h后尾靜脈注射Ig-Y 空載抗體（2 mg/kg）；（2）假手術－中和抗體（Sham-A）組：只穿線不結扎LAD，1 h后尾靜脈注射HMGB1 中和抗體（2 mg/kg）；（3）I/R-A 組：心肌缺血30 min后恢復血流灌注30 min時，尾靜脈注射HMGB1 中和抗體（2 mg/kg），繼續灌注至3 h；（4）I/R-G 組：心肌缺血30 min 后恢復血流灌注30 min 時，尾靜脈注射Ig-Y 空載抗體（2 mg/kg），繼續灌注至3 h；（5）Sham-NC組：只穿線不結扎LAD，1 h后尾靜脈注射生理鹽水（2 mg/kg）

1.4 Evans blue-TTC 雙重染色法檢測心肌梗死面積 再灌注3 h 后，深度過量麻醉小鼠，打開胸腔，再次原位結扎小鼠LAD，經主動脈逆行注射Evans blue 溶液約0.75 mL，取出心臟，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，心臟變硬后，自心尖處連續橫切厚度1 mm的切片（共5片），PBS清洗，放入1%TTC溶液中，37 ℃避光水浴15 min。染色成功后，用4%多聚甲醛溶液固定切片24 h。拍照，用Image J軟件分析染色面積。TTC 染色為紅色（梗死邊緣區）和白色（梗死區）的區域為危險區（AAR），正常心肌經Evans blue染色為深藍色。計算梗死區面積占AAR面積的百分比。

1.5 血漿HMGB1、LDH 水平檢測 再灌注3 h 后，再次麻醉小鼠，使用眼球采血法收集小鼠全血，置于1.5 mL 離心管中，室溫靜置15 min，4 ℃離心10 min后小心吸取上層血漿，采用ELISA法檢測血漿HMGB1、LDH 水平。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 免疫熒光法檢測線粒體自噬水平 取小鼠心前區心肌組織制作石蠟切片，PBS 洗滌，甩干后在3%雙氧水中室溫避光孵育約25 min封閉過氧化物酶；PBS 洗滌，滴入3%BSA 溶液，室溫下避光孵育約 30 min。加入LC3 一抗（1∶5 000），4°C 冰箱孵育過夜后加入對應山羊抗兔HRP 二抗（1∶500），室溫孵育50 min，再于CY3-TSA孵育10 min。取出切片，放于EDTA抗原修復緩沖液（pH 8.0）中，置于微波爐內中火8 min 后轉中低火7 min 進行抗原熱修復。之后加入一抗HSP60（1∶800），4°C 冰箱孵育過夜后加入對應山羊抗兔HRP二抗（1∶400）避光室溫孵育50 min。DAPI染核避光孵育10 min，PBS洗滌5 min，重復3次，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察結果。可見呈點狀藍色的心肌細胞核和呈點狀綠色熒光的自噬泡以及呈紅色熒光的線粒體基質蛋白。

1.7 Western blotting 法檢測HMGB1、LC3、P62 蛋白表達 將心前區心肌組織按100 mg/mL 加入RIPA 裂解液，于超聲破碎儀中勻漿3次，冰上裂解30 min，離心，吸取上清。使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸6 min 使蛋白變性。SDSPAGE分離蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗HMGB1、LC3、P62、GAPDH（均為1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜3 次，5 min/次；加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL顯色，FluorChem FC3 成像系統（Proteinsimple 公司，美國）顯影、拍照，Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿HMGB1水平比較 與Sham-G組比較，Sham-A 組血漿HMGB1 水平顯著降低（P＜0.05），I/R-A組、I/R-G組血漿HMGB1水平明顯升高（P＜0.05）；與I/R-G 組比較，I/R-A 組血漿HMGB1水平顯著降低（P＜0.05）；Sham-G 組與Sham-NC 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血漿HMGB1水平比較

2.2 4組小鼠心肌梗死面積及血漿LDH水平比較與Sham-G 組比較，I/R-A 組、I/R-G 組小鼠心梗面積顯著增加（P＜0.05）；與I/R-G組比較，I/R-A組小鼠心肌梗面積顯著減少，血漿LDH水平顯著降低（均P＜0.05），見圖2。

2.3 4 組心肌HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62 蛋白表達量比較 與I/R-G 組比較，I/R-A 組心肌組織HMGB1蛋白表達量和LC3-II/I比值明顯降低，而P62蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05），見圖3。

2.4 4 組心肌組織線粒體自噬情況 I/R-A 組心肌組織中HSP60與LC3的共定位熒光強度較I/R-G組明顯減弱，見圖4。

圖2 4組心肌梗死及血漿LDH水平比較

圖3 4組HMGB1、P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量比較

圖4 4組心肌組織線粒體自噬情況

3 討論

CVD 是全球最主要的死亡原因[13]。急性心肌梗死（AMI）則是不論在發展中國家還是發達國家中都被認為是CVD 發病率和死亡率的主要原因[14-15]。早期成功進行溶栓治療或直接接經皮冠狀動脈介入治療（PCI）恢復缺血心肌的血流量是治療急性心梗的最有效策略。然而再灌注會對心肌造成額外的損傷和并發癥，是CVD治療的主要障礙[16-18]。糖尿病被認為是AMI 的獨立危險因素[19]。糖尿病患者心肌梗死后的發病率、死亡率和再梗死率遠高于非糖尿病患者[20-21]。有研究認為，糖尿病增加了心肌對I/R損傷的易感性[22]。糖尿病I/R損傷加重的機制尚不清楚，但繼發于高血糖的增加的氧化應激可能起到重要作用。

有研究表明，糖尿病患者氧化應激增加的原因主要是內源性抗氧化防御系統產生和清除活性氧（ROS）之間的失衡，這種失衡的程度與I/R 損傷的程度密切相關[23]。增高的氧化應激會損害線粒體能力代謝，導致線粒體功能障礙，而損傷的線粒體又會產生更多的ROS，產生惡性循環[24]。

線粒體自噬是一種選擇性自噬，可以清除細胞內過多或損傷的線粒體。在心肌細胞中，線粒體自噬是否對應激有保護作用一直存在爭議。有研究發現，無論是在由缺糖誘導的缺血心肌細胞系還是活體小鼠缺血模型中，自噬的減少會伴隨著心肌細胞存活率的下降以及心臟功能障礙，提示自噬有保護作用[8]。而在再灌注期間，自噬會進一步加重。用3-甲基腺嘌呤或N-2-巰基丙酰甘氨酸、Beclin 基因敲除抑制自噬后，體外或體內的I/R 心肌細胞存活率升高，心梗面積減少[25-26]。適度的自噬可以及時清除受損線粒體以維持內環境的穩定，而過度的自噬或者線粒體自噬發生缺陷會加重再灌注損傷。

HMGB1是一種染色質相關的核蛋白和細胞外損傷相關模式分子（DAMP）。可從壞死細胞中被動釋放，也可從激活的免疫細胞中主動分泌至細胞外。作為促炎細胞因子在感染、損傷、炎癥的發病機制中發揮關鍵作用[27]。HMGB1被證實在心肌I/R期間作為炎癥和細胞損傷的早期介質來介導炎癥反應和器官損傷，加重了再灌注的損傷。MIRI模型中循環和心肌HMGB1 水平明顯增加，有助于再灌注期間梗死進一步加重[28]。降低HMGB1表達或靶向缺失HMGB1 后，顯著減輕I/R 組織損傷，發揮保護作用[11,29]。此外，有研究表明，HMGB1 在促進細胞自噬和線粒體自噬中作為關鍵調節因子，將氧化還原、生物能量學和新陳代謝與自噬調節聯系起來。靶向缺失HMGB1后自噬顯著下降[9]。HMGB1在糖尿病心肌病的發展中起著重要作用，持續激活促炎途徑和增強心肌損傷[11,30]。

目前研究認為，糖尿病心肌I/R 和氧化應激ROS 升高相關。這些機制大部分與線粒體障礙密切相關。糖尿病心臟病更是被有些學者認為是線粒體疾[31-32]。而HMGB1 是線粒體自噬的關鍵調節因子，氧化還原誘導HMGB1易位，可與晚期糖基化終產物結合導致持續的促炎途徑激活和增強的心肌損傷，還可調控熱休克蛋白β1（HSPB1）維持線粒體形態和掌控線粒體自噬[33]。有研究發現，糖尿病心肌I/R 大鼠經藥物治療后其心功能顯著改善，同時HMGB1 表達明顯下降[34]。本研究結果提示HMGB1可促進糖尿病小鼠心肌I/R損傷，其機制與其介導線粒體自噬密切相關。

本研究結果表明，HMGB1 中和抗體能夠有效抑制心肌I/R誘導糖尿病小鼠心肌釋放HMGB1，且Ig-Y 空載抗體對db/db 小鼠的HMGB1 水平沒有影響，排除了空載抗體本身的影響（P＜0.05）。LC3蛋白是自噬體形成的關鍵蛋白，自噬過程中胞質型的LC3-I被自噬相關蛋白切割后與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ，后者被招募至自噬體膜上，故一般用LC3Ⅱ/Ⅰ的比值來反應自噬程度[35]。LC3Ⅱ/Ⅰ上升提示自噬增強或者自噬清除障礙。P62是自噬底物的標志，P62 下降提示自噬增加。本研究中，I/R-G組相較于I/R-A組HMGB1明顯增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，P62 蛋白表達下降（P＜0.05）。LC3 與線粒體共定位免疫熒光染色同樣顯示I/R-G組自噬與線粒體共定位強度明顯增強，自噬發生在線粒體上。

綜上，HMGB1 可促進糖尿病小鼠心肌I/R 損傷，其機制與其介導線粒體自噬密切相關。今后將就其具體機制進行進一步的驗證。