基于單細胞轉錄組測序技術的膀胱癌區域免疫特性的研究*

曾燕玉，包夢穎，代 艷，黃 榮，毛星寧，王逸夫，郭冰倩，顏赟坤，張慶云.5，莫曾南△

（1.廣西醫科大學基因組與個體化醫學研究中心，南寧 530021；2.廣西生物醫藥協同創新中心（廣西－東盟重大疾病防治協同創新中心），南寧 530021；3.廣西基因組與個體化醫學研究重點實驗室，南寧 530021；4.廣西基因組與個體化醫學研究協同創新中心，南寧 530021；5.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧 530021）

膀胱癌（bladder cancer,BC）是常見的惡性泌尿系統腫瘤，2018 年全球新發病例約549000 例[1]。近年來腫瘤免疫檢查點抑制劑的研究進展迅速，為BC 的治療開啟了新的篇章[2]。腫瘤免疫療法面臨的一大挑戰是對組織特異性腫瘤免疫應答理解不足，不同解剖部位的免疫環境可能對抗腫瘤免疫效果產生影響[3]。闡明腫瘤免疫微環境組分對提高免疫治療效果至關重要，目前對BC 及膀胱組織的免疫概況尚缺乏深入的研究。

流式細胞術、免疫組化和免疫熒光等方式常被用于研究免疫細胞，但這些手段往往需要提前設置或挑選已知的標記物組合，導致一些新的細胞類型無法被檢出。傳統的高通量測序實驗獲取的數據代表細胞樣本整體的特征，忽略了細胞間的差異。單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術能夠從單個細胞的轉錄組水平闡釋細胞的異質性，為理解腫瘤微環境提供全新的視角，Azizi 等[4]用scRNA-seq 繪制了乳腺癌免疫圖譜。本研究采用scRNA-seq 對BC及其配對非惡性組織中的浸潤免疫細胞進行分群，比較免疫細胞組成的差異，為研究BC 區域免疫特性提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收取2019 年11 月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院接受根治性膀胱切除術組織1 例，包括膀胱癌組織（tumor）和非惡性膀胱組織。病例納入標準：（1）術前影像學或活檢病理提示尿路上皮癌；（2）術后病理診斷為BC。排除標準：（1）存在明顯感染病灶；（2）患有自身免疫性疾病；（3）兩周內曾接受膀胱化療藥物灌注治療。本研究中患者為男性，術后診斷為原發肌層浸潤性BCT3aN0M0期。患者術前未經介入、放療和化療等非手術治療。本研究經廣西醫科大學醫學倫理委員會批準，患者及其家屬術前均簽署知情同意書。

1.2 試劑

HBSS 和DPBS 均購自WISENT 公司；I 型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素雙抗溶液和臺盼藍均購自Gibco 公司；DNAse Ⅰ購自Roche 公司；紅細胞裂解液購自Biolegend 公司；單細胞油包水制備和轉錄組文庫構建試劑盒（Chromium Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3、Chromium Chip B Single Cell Kit 和Chromium i7 Multiplex Kit）均購自10X Genomics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單細胞懸液制備 取膀胱根治術中切除的膀胱癌組織和非惡性膀胱組織存放至預冷的緩沖液（含1%雙抗試劑的HBSS溶液）中運輸回實驗室，用預冷的DPBS 清洗組織，用無菌手術剪刀將組織塊剪碎，全程在冰上操作。將每種組織各分為2份，分別轉移至含Ⅰ型膠原酶的消化液和含Ⅱ型膠原酶的消化液中，在37 ℃水浴鍋中搖勻消化40 min。加入預冷的DPBS 終止消化，用100 μm 的細胞篩進行過濾得到細胞懸液，300 g 離心5 min，棄去上清，加入含1%FBS的DPBS清洗細胞，300 g離心5 min,棄去上清。加入適量的紅細胞裂解液冰上裂解5 min，加入含1%FBS的DPBS后使用40 μm的細胞篩進行過濾，300 g離心5 min，離心均在4 ℃條件下進行。使用含1%FBS的DPBS清洗細胞，棄去上清后重懸細胞，取細胞懸液與臺盼藍等比例混合染色，鏡檢計數，活率＞80%的細胞懸液用于后續實驗。

1.3.2 油包水制備及文庫構建 組裝好芯片與底座，配置樣本混合液，依次將75 μL 樣本混合液，40 μL 震蕩30 s 后的Gel beads 和280 μL patitioning oil加至芯片上對應的孔，封上墊片，放入10X Chromiun Chromium Controller儀器大約8.5 min，用移液槍轉移100μL制備好的油包水立刻進行逆轉錄。按照Chromium Single Cell 3?Reagent Kits v3 用戶指南進行后續的cDNA純化擴增及文庫構建。

1.3.3 測序 構建好的文庫經過安捷倫2100 質檢合格后在Illumina NovaSeq S6000 測序儀上進行測序。

1.4 scRNA-seq數據分析

1.4.1 數據預處理和質控 使用10X Genomics 公司提供的Cell Ranger（3.0.2）軟件將原始數據拆分為FASTQ 文件，進行序列拼接，對比到人參考基因組（GRCh38），得到基因表達矩陣。在R 3.5.2（https://www.r-project.org/，2021-04-13）中讀取基因表達矩陣，安裝R 包Seurat 3.1.1（https://satijalab.org/seurat/，2020-03-10）用于后續分析。對樣本分別進行質控，即過濾低豐度基因和低質量細胞。

1.4.2 數據整合和降維聚類 將質控后的數據使用NormalizeData 函數進行標準化，使用FindVariableFeatures 函數選擇高變基因。使用FindIntegrationAnchors和IntegrateData函數進行數據整合并消除批次效應，使用ScaleData函數將合并后的數據歸一化。數據進一步進行主成分分析（PCA，線性降維），使用FindClusters 函數對細胞進行無偏倚聚類并采用UMAP的方式可視化降維。

1.4.3 細胞注釋 使用FindAllMarker 函數找出每個細胞簇相對其余細胞簇差異表達顯著的基因，根據細胞簇的基因表達情況，結合參考已發表的10X單細胞轉錄組測序文獻與相關細胞亞群的研究綜述對細胞類群進行注釋。

1.4.4 差異基因分析 使用FindMarkers函數分析不同組織來源的同個細胞亞群的差異表達基因，使用R包ggplot2繪制火山圖，使用GEPIA 2（http://gepia2.cancer-pku.cn/,2021-04-13）在線工具進行差異基因的生存分析。

2 結果

2.1 單細胞轉錄組測序技術分析BC區域免疫特性的流程

為了描繪BC 區域免疫特性，本研究使用機械聯合酶解的方式對組織進行解離，并通過單細胞轉錄組測序技術對其細胞組分進行檢測，見圖1；利用單細胞分辨率下的轉錄組信息解析BC免疫細胞的種類與特征。

2.2 基本測序結果

將膀胱癌組織和非惡性膀胱組織樣本分別進行質控，先計算樣本中細胞的基因數（nFeature）、轉錄本數（nCount）、線粒體基因比例（percent.mt）和血紅蛋白基因比例（percent.HB），見圖2A、圖2B；再結合計算結果與組織樣本特性設置過濾條件。本研究設置過濾低豐度基因（在少于3 個細胞中表達的基因）和低質量細胞（基因數≤200或者≥5000、線粒體基因比例≥10%和血紅蛋白基因比例≥5%的細胞）。將質控后的數據標準化后選擇2000個高變基因，進行2個樣本的整合并消除批次效應，最終共獲得11459個細胞的轉錄組信息，其中6559 個細胞來源于膀胱癌組織，4900個細胞來源于非惡性膀胱組織。通過無偏倚聚類和UMAP 可視化降維后共分成22個細胞簇，見圖2C；熱圖展示每個細胞簇差異表達顯著的基因，見圖2D。

2.3 注釋免疫細胞與非免疫細胞

本研究共檢測出10簇非免疫細胞，11簇免疫細胞和1 簇未定義的混雜細胞(第21 簇)。PTPRC基因編碼的CD45蛋白（白細胞共同抗原）在免疫細胞的成熟與分化中起重要作用[5-6]，第2、第3、第4、第5、第7、第8、第11、第12、第14、第15、第19 和第21簇細胞表達PTPRC，其中第8 簇細胞僅有少部分細胞表達PTPRC且表達量很低，見圖3A、圖3B。參考已報道的scRNA-seq研究[7]定義非免疫細胞簇，同時滿足以下2個條件：不表達或低表達PTPRC；高表達特定細胞的標記基因。定義出非免疫細胞包括成纖維細胞（fibroblasts）、內皮細胞（endothelial cells）、周細胞（pericytes）和上皮細胞（epithelial cells），見表1 和圖3C。免疫細胞包括T 細胞3 簇：CD4+T 細胞（CD4+T cells）、CD8+T細胞（CD8+T cells）和增殖性T 細胞（proliferating T cells）；B 細胞2 簇：漿細胞（plasma cells）和B 細胞（B cells）；單核-巨噬細胞4 簇：單核細胞（monocytes）、M2 樣巨噬細胞（M2-like macrophages）、巨噬細胞（macrophages）和單核樣細胞（monocyte-like cells）；樹突狀細胞（dendritic cells）；肥大細胞（mast cells）。見表2和圖3D。

2.4 BC區域免疫特性

膀胱癌組織中含量最豐富的免疫細胞是CD4+T 細胞，其次是CD8+T 細胞，非惡性膀胱組織中含量最高的是M2 樣巨噬細胞，其次是單核細胞。在膀胱癌組織中4 簇單核巨噬細胞占比均降低，而漿細胞明顯在膀胱癌組織中富集，見圖4A。通過對比UMAP 圖中細胞簇的組織來源情況發現膀胱癌組織來源與非惡性膀胱組織來源的漿細胞分布的位置重合度不高，提示不同組織來源的漿細胞可能在基因表達上存在差異，見圖4B。進一步差異基因分析顯示膀胱癌組織中的漿細胞MT1X、G0S2、CCDC80、IGHG2和LYZ等基因表達量增高，IGHA2、IGLV-57、SELENOP、RNASE1和EGR1等基因表達量下調，見圖4C。將表達量增高最顯著的MT1X基因做生存分析，結果提示高表達MT1X的BC患者預后較差（LogrankP=0.0015），見圖4D。

圖1 單細胞轉錄組測序工作流程及數據分析

圖2 單細胞測序質控及細胞聚類

圖3 BC與非惡性膀胱組織中免疫細胞與非免疫細胞的注釋

表1 非免疫細胞特征基因

表2 免疫細胞特征基因

圖4 膀胱癌組織與非惡性膀胱組織區域免疫特性

3 討論

BC 是我國男性發病率居首位的泌尿系統腫瘤[23]，治療方式包括化療、放療及膀胱根治術等，患者的生活質量下降[24]，免疫檢查點抑制劑治療成為一種新的治療手段，多種藥物已被批準用于BC 的治療。腫瘤內免疫抑制的環境是影響免疫治療效果的重要因素[25]，對腫瘤微環境成分的探索將有助于更好地選擇免疫治療方案。單細胞轉錄組測序可以從單個細胞的維度對腫瘤微環境進行檢測，辨析細胞的種類與狀態，利于發現免疫治療的靶細胞或篩選可能獲益于免疫檢查點抑制劑治療的患者群體。

本研究對膀胱癌微環境中的細胞進行分析，檢測出10 個非免疫細胞簇和11 個免疫細胞簇。PTPRC在免疫細胞簇中表達，在非免疫細胞簇中表達量極低或幾乎不表達，但漿細胞簇中PTPRC表達量很低。在膀胱癌組織中的免疫細胞類型主要是T細胞，在非惡性膀胱組織中以單核－巨噬細胞為主。漿細胞在膀胱癌組織中富集，并且兩種組織中漿細胞的基因表達顯示出明顯的差異，膀胱癌組織中的漿細胞MT1X表達上調。MT1X編碼的金屬硫蛋白與維持金屬離子穩態有關，并在腫瘤生長、進展、轉移和耐藥性中發揮關鍵作用[26]。高表達MT1X的BC 患者預后不良，這些結果提示膀胱癌中的漿細胞可能影響膀胱癌的進展與預后。

綜上所述，本研究利用單細胞轉錄組測序技術成功建立探究BC區域免疫特性的方法，PTPRC的表達情況可以作為scRNA-seq分析中輔助區分免疫細胞與非免疫細胞的參考依據。在正常情況下人體內漿細胞的成熟會伴隨表面CD45 表達量的下降，病理情況下如多發性骨髓瘤患者體內會出現CD45陽性和CD45陰性2種漿細胞群[27]。相對以往使用流式細胞術分選出CD45陽性細胞作為免疫細胞群體進行的研究設計，以未經分選的單細胞懸液作為樣本具有更高的概率檢出CD45陰性或者弱陽性的免疫細胞群，為探究免疫組分提供了更全面的策略。

本研究存在一定的局限性：一、組織是較為復雜的環境，消化酶種類的選擇可能一定程度上會造成獲取的細胞亞群的偏倚；二、基于轉錄組信息得到的特征需要進行進一步驗證；三、由于樣本量的限制，細胞簇的分布特征與差異基因表達情況不具備統計學意義。