電紡PCL、PLA和PVA納米纖維膜的制備、表征及細胞活性的研究*

馬 可，梁銳明△，蘇 偉

（1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧 530021）

靜電紡絲技術在國內一般簡稱為電紡，是一種利用聚合物流體在強電場作用下，通過金屬噴嘴進行噴射拉伸而獲得直徑為幾十納米或幾微米納米級纖維的紡絲技術[1]。靜電紡絲技術具有操作簡單、成本小、產量高、工藝可控等優(yōu)勢，近年來被廣泛應用于各個領域[2-3]。靜電紡絲制備出來的納米纖維膜具有較高的孔隙率、比表面積，形態(tài)結構類似于細胞外基質的特點[4]，可以作為組織工程支架、引導骨再生膜、皮膚修復敷料等應用于骨組織、心肌、神經、肌腱再生、神經、心肌、及傷口愈合，在生物醫(yī)學工程、再生醫(yī)學等領域有廣泛的應用。同時，納米纖維膜的形態(tài)結構、直徑大小以及機械性能影響細胞的黏附、遷移、增殖、分化等，因此，制備成具有不同形態(tài)結構和機械性能的納米纖維對組織再生和修復發(fā)揮重要作用。

在納米纖維膜制備過程中，靜電紡絲對溶液的濃度有一定的要求，濃度過大導致粘度過高，從而導致難以電紡；溶液濃度過小，聚合物分子鏈之間纏結不充分，則會導致電紡絲表面出現(xiàn)許多串珠，影響纖維直徑[5]。接收速度同樣也影響著纖維的形貌和直徑，接收速度的增加，纖維被拉伸，直徑變細。同時，纖維的結構和平均直徑又影響著其機械性能[1]。因此，選擇合適的濃度和接收速度是制備出直徑分布均勻和排布、較高孔隙率、優(yōu)良機械性能的納米纖維膜的關鍵。此外，電紡納米纖維的形態(tài)結構和直徑大小又影響著細胞在其表面的生長狀態(tài)和增殖能力[6-7]。

本研究選用了良好的生物相容性、良好的生物降解性和FDA批準的聚己內酯（PCL），良好的生物相容性和親水性的聚乙烯醇（PVA）以及天然的、可降解的脂肪族熱塑性聚酯聚乳酸（PLA），利用靜電紡絲技術制備不同濃度和接收速度的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜。通過纖維膜的形貌觀察并計算平均直徑、機械性能檢測，探討不同濃度和接收速度對納米纖維膜形態(tài)結構和機械性能的影響。同時，將大鼠的骨髓間充質干細胞培養(yǎng)于電紡納米纖維膜表面，通過CCK-8檢測和活死細胞染色來探究納米纖維膜形態(tài)結構和直徑大小對細胞生長狀況的影響，為電紡纖維膜在生物醫(yī)學工程和再生醫(yī)學領域的應用提供理論借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料 PCL:純度≥97%，Sigma-Aldrich，中國；PLA:分析純，麥克林，中國；PVA:醇解度87%～89%，麥克林，中國；六氟異丙醇：純度≥99.5%，麥克林，中國。α-Dulbecco’s Modified Eagle Medium(α-DMEM),Gibco，美國；胎牛血清，Gibco，美國；青鏈霉素混合液，索萊寶，中國；胰蛋白酶，索萊寶，中國；PBS 緩沖液，索萊寶，中國；CCK-8，Dojindo，日本；SD 乳鼠，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，中國。Calcein-AM/PI染色試劑盒，Invitrogen，美國。

1.2 儀器 靜電紡絲機：HD1311，蘇州能環(huán)新材料科技有限公司，中國；磁力攪拌器：MSH-20，KEWLAB，澳洲；真空干燥箱：LW-ZDW-4，南京龍伍機械有限公司，中國；電子精密天平：XPE105，METTLER，TOLEDO，瑞士；掃描電子顯微鏡：TESCAN，VEGA3LMU，捷克；超聲波清洗機：SB25-12，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國；力學測試儀：Instron 5943，NSTRON，美國。細胞恒溫培養(yǎng)箱：BB5，Thermo Fisher，美國；超凈工作臺：HCB，海爾，中國；倒置相差顯微鏡：BX53F，OLYMPUS，日本；全波長酶標儀：Multiskan GO，Thermo Fisher，美國。

1.3 實驗方法 分別稱取適量PCL、PLA、PVA 溶于5 mL 的六氟異丙醇溶液中，配制成不同濃度的PCL（4%、6%和8%）、PLA（8%、10%和12%）、PVA（0.4%、0.8%和1.2%）混合溶液，置于磁力攪拌器上攪拌6 h，并超聲30 min 使其充分混勻，制備成靜電紡絲溶液。將制備的電紡溶液置于靜電紡絲機的注射器上進行電紡。在濃度對纖維膜纖維影響的研究中，選取不同的PCL、PLA和PVA原料濃度，設置紡絲的接收速度為20 r/min；在接收速度對纖維膜纖維影響的研究中，分別選取6% PCL、10%PLA、0.8%PVA 電紡溶液，設置紡絲的接收速度分別為20 r/min、80 r/min和140 r/min進行電紡。其他條件設置為電壓為15 kV，噴射速度0.8 mL/h，噴嘴與收集器距離15 cm。環(huán)境條件為溫度25 ℃，濕度為35%～55%。將上述制備好的纖維膜置于真空干燥箱中干燥24 h后使用。

1.4 納米纖維膜形態(tài)結構、纖維直徑和力學性能檢測 利用掃描電鏡（SEM）觀察不同條件制備的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜的形態(tài)結構，并隨機選取50根纖維，利用Image軟件測量它們的直徑分布并計算平均直徑。

利用力學儀器對不同條件制備的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜進行拉伸實驗來探究它們的機械性能（拉伸應力、拉伸應變和楊氏模量）。將每一種電紡納米纖維膜裁剪成大小為20 mm×10 m 的矩形，并用游標卡尺測量纖維膜的厚度，上機測量，設置初始距離為1 cm，拉伸速率為6 mm/min，每個樣本重復測量3次。

1.5 細胞培養(yǎng) 向3 d大小的SD乳鼠體內注射3%的戊巴比妥鈉溶液，隨后將乳鼠置于75%的酒精中滅菌處理。在無菌條件下，利用高壓好的剪刀和鑷子將乳鼠的四肢剪下，置于含有5%的雙抗和PBS緩沖液中，同時將其轉移到超凈臺中進行下一步操作。將四肢取出并用PBS 清洗后，置于培養(yǎng)基中，利用無菌紗布將肌肉組織剔除干凈，再將軟骨剪下，利用注射器將骨髓沖出到培養(yǎng)皿中。最后，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換一次液，取三代細胞進行后續(xù)實驗。

1.6 細胞接種及活力檢測 將電紡納米纖維膜置于24 孔板中，并用銅環(huán)壓住，加入75%酒精浸泡6 h，隨后，將酒精吸去，在紫外燈下滅菌12 h。將細胞取出，吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min，再加入2 mL培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉移到離心管中，1 000 r離心5 min，棄去上清，再加入5 mL 培養(yǎng)基重懸細胞，接著進行細胞計數(shù)，最后以3×104細胞/孔的密度接種于納米纖維膜上，培養(yǎng)3 d。

3 d后取出孔板，將培養(yǎng)液吸去，PBS清洗3遍，在避光的條件下，每孔中加入25 μL CCK-8 和250 μL 培養(yǎng)液，孵育2 h，隨后，將24 孔板中的混合液轉移到96 孔板中，利用全波長酶標儀在450 nm 處測定吸光度值。3 d 后取出孔板，將培養(yǎng)液吸去，PBS清洗3遍，在避光的條件下，加入活死細胞染色液孵育5 min，吸去染色液，隨后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 溶液濃度對纖維形態(tài)結構和直徑的影響 不同濃度（4%、6%和8%）的PCL納米纖維的掃描電鏡圖（圖1）。當溶液濃度為4%時，纖維表面出現(xiàn)較多的串珠，隨著濃度的增加，串珠隨之減少。

8%和10%的PLA以及0.4%的PVA的纖維表面出現(xiàn)了串珠，并且隨著濃度的增加串珠減少，纖維變得均勻（圖2、圖3）。

PCL、PLA 和PVA 3 種纖維的平均直徑均小于1 μm，并且隨著紡絲液濃度的增大，平均直徑也隨之增大，見表1、表2和表3。

圖1 不同濃度的PCL電紡纖維的SEM

圖2 不同濃度的PLA電紡纖維的SEM

圖3 不同濃度的PVA電紡纖維的SEM

表1 不同濃度的PCL電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表1 不同濃度的PCL電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表2 不同濃度的PLA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表2 不同濃度的PLA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表3 不同濃度的PVA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表3 不同濃度的PVA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

2.2 接收速度對纖維形態(tài)結構和直徑的影響 濃度分別為6%、10%、0.8%的PCL、PLA和PVA 3種纖維膜在80 r/min和140 r/min的接收速度下的電鏡圖像，見圖4、圖5 和圖6。與圖1b、圖2b、圖3b 相比，隨著轉速的加大，纖維的排列逐漸規(guī)整，但是由于靜電紡絲機的最大轉速只能達到140 r/min，所以沒有得到排列方向高度一致的纖維。

圖4 不同接收速度所得的PCL電紡纖維的SEM

圖5 不同接收速度所得的PLA電紡纖維的SEM

圖6 不同接收速度所得的PVA電紡纖維的SEM

表4、表5和表6顯示，隨著轉速的加大，纖維直徑逐漸變小。

表4 不同接收速度所得的PCL 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表5 不同接收速度所得的PLA 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表6 不同接收速度所得的PVA 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

2.3 溶液濃度對纖維膜機械性能的影響 對不同濃度的PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜的力學性能進行了測試，結果表明，隨著濃度的增加，3 種纖維膜的力學性能先增加后降低，見表7、表8、表9。

表7 不同濃度的PCL電紡纖維膜的力學性能

表7 不同濃度的PCL電紡纖維膜的力學性能

與4%組比較，*P＜0.05。

表8 不同濃度的PLA電紡纖維膜的力學性能

表8 不同濃度的PLA電紡纖維膜的力學性能

與8%組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表9 不同濃度的PVA電紡纖維膜的力學性能

表9 不同濃度的PVA電紡纖維膜的力學性能

與0.4%組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 接收速度對纖維膜機械性能的影響 從不同濃度的纖維膜中選出力學性能較好的濃度，分別為6%、10%、0.8%的電紡PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜，將接收速度分別設置為20 r/min、80 r/min 和140 r/min。對通過不同接收速度所得到的纖維膜進行力學測試，結果表明，隨著接收速度的增加，3 種纖維膜的力學性能逐漸降低，見表10、表11和表12。

2.5 溶液濃度對纖維膜細胞活力的影響 種植有BMSCs的不同濃度的PCL、PLA和PVA納米纖維膜的CCK-8 檢測結果，見圖7。圖7a 和圖7b 表明，與對照組相比，不同濃度的PCL和PLA納米纖維膜均可促進細胞增殖（均P＜0.05），并且細胞活力隨著濃度的增加而增加（均P＜0.05），而圖7c表明，不同濃度的PVA的細胞活力均較對照組低（均P＜0.05）。

表10 不同接收速度所得的PCL電紡纖維膜的力學性能

表10 不同接收速度所得的PCL電紡纖維膜的力學性能

與20 r/min組比較，***P＜0.001

表11 不同接收速度所得的PLA電紡纖維膜的力學性能

表11 不同接收速度所得的PLA電紡纖維膜的力學性能

與20 r/min組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

表12 不同接收速度所得的PVA電紡纖維膜的力學性能

表12 不同接收速度所得的PVA電紡纖維膜的力學性能

與20 r/min組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

種植有BMSCs 的不同濃度的PCL 納米纖維膜的活死細胞染色結果，見圖8。與對照組相比，隨著濃度的增加，PCL納米纖維膜上的細胞數(shù)量增多密度增大。

2.6 接收速度對纖維膜細胞活力的影響 從不同濃度的纖維膜中選出力學性能較好的濃度，分別為6%、10%、0.8%的電紡PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜，將接收速度分別設置為20 r/min、80 r/min 和140 r/min。對通過不同接收速度所制備的纖維膜進行CCK-8 檢測,結果表明，與對照組相比，不同接收速度的PCL和PLA納米纖維膜均可促進細胞增殖，并且細胞活力隨著接收速度的增加而增加，見圖9a和圖9b，而當接收速度為20 r/min時，細胞活力低于對照組，隨著接收速度的增加，細胞活力隨之改善，見圖9c。

通過不同接收速度所制備的PCL 電紡纖維膜的活死細胞染色結果，見圖10。結果表明，隨著接收速度的增加，細胞的形態(tài)被拉伸，沿著納米纖維的方向有序的生長，細胞之間相互連接，趨于融合。

圖7 種植有BMSCs的不同濃度的PCL、PLA和PVA電紡纖維膜的cck-8檢測結果

圖8 種植有BMSCs的不同濃度的PCL電紡纖維膜的活死細胞染色結果

圖9 種植有BMSCs并通過不同接收速度所制備的PCL（a）、PLA（b）和PVA（c）電紡纖維膜的CCK-8檢測結果

圖10 種植有BMSCs并通過不同接收速度所制備的PCL電紡纖維膜的活死細胞染色結果

3 討論

靜電紡絲技術因其操作簡單、產量較高、參數(shù)可調等優(yōu)勢得到廣泛應用。改變參數(shù)和紡絲液濃度可以影響所制備出的納米纖維膜的形態(tài)結構和性質功能，從而影響細胞在其表面的生長狀態(tài)。

在電紡參數(shù)相同的情況下，溶液濃度較小時，電紡纖維膜表面易出現(xiàn)串珠，并且纖維直徑較小，隨著濃度的增加，纖維膜表面結構得到改善并且纖維直徑增加。這是因為當溶液濃度過小時，溶液黏度較小，在電場中難以形成射流，聚合物分子鏈之間纏結不充分，在纖維表面形成一些珠狀結構[8-9]。同時，隨著溶液黏度的增大，射流在電場中的分化能力得到了降低，導致纖維平均直徑增大[10]。隨著濃度的增加，納米纖維表面形態(tài)得到改善，串珠減少，這時納米纖維的結構更好的模擬了細胞外基質，可作為促進細胞生長的良好的支架。本研究結果表明，當濃度相同時，隨著接收速度的增加，納米纖維膜的形態(tài)結構趨于規(guī)整，直徑逐漸變小，這是由于接收速度加快，纖維被過度拉伸，導致纖維的平均直徑縮小[11]。通過提高滾筒的接收速度來得到排列有序的納米纖維，從而提高納米纖維膜的促細胞生長能力[12-14]。本研究結果顯示，當濃度相同時，隨著接收速度的提高，納米纖維排列趨于有序的狀態(tài)，纖維直徑也隨之減小，從而增大了空隙，使細胞可以沿著纖維的方向有序生長，較高的孔隙率有利于細胞粘附以及浸潤性生長。

參數(shù)與溶液濃度的改變不僅影響納米纖維膜的形態(tài)和直徑，也會影響其機械性能。當其他參數(shù)相同時，隨著溶液濃度的增加，3種纖維膜的機械性能先升高后降低，這是由于當紡絲液濃度較小時粘度也較小，此時分子鏈纏結不良，纖維膜表面結構較差，導致機械性能較低；當濃度逐漸升高時，力學性能得到改善[11]。當濃度進一步增加時，溶液黏度較大，電紡過程受到影響，因此，力學性能隨之降低。當溶液濃度相同時，隨著接收速度的增加，3種纖維膜的機械性能隨之降低。這是由于隨著接收速度的增加，纖維被拉伸，直徑變細，纖維膜厚度變薄，纖維略微出現(xiàn)取向性，纖維之間的接觸點有所減少，導致纖維膜的機械性能變差[11]。

綜上所述，通過改變紡絲液濃度和紡絲參數(shù)可以改變PCL、PLA 和PVA3 種電紡納米纖維的表面形貌與直徑大小，從而進一步影響了機械性能以及它們對細胞的促生長能力。