香煙煙霧提取物抑制小鼠骨骼肌細胞再生的機制研究*

鄭桂賢，李 超，鄧招惠，謝 婷，霍增榆，韋鑫燕，白 晶

（廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，南寧 530021）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的以持續氣流受限為特征的慢性肺部疾病。肌少癥（sarcopenia）是COPD 常見的合并癥，表現為骨骼肌質量和力量的下降，伴隨著軀體殘疾、生活質量下降和死亡的風險。COPD 合并肌少癥患者疾病預后差，病死率高[1]。骨骼肌質量的維持與骨骼肌細胞代謝、骨骼肌干細胞（衛星細胞）肌再生能力有關[2-3]。COPD合并肌少癥的研究，集中在骨骼肌細胞代謝與骨骼肌萎縮、衰老方向[3]，對骨骼肌衛星細胞的研究甚少。研究顯示，衛星細胞數量、活性等下降是導致骨骼肌丟失的重要原因[4]。煙草煙霧調控小鼠骨骼肌衛星細胞再生能力的相關機制尚未見研究報道。小鼠C2C12 成肌細胞是來源于骨骼肌前體細胞的肌源細胞，使用2%馬血清培養6 d可將細胞誘導分化為成熟的骨骼肌細胞[5]，被廣泛用于肌肉再生的體外模型研究。本實驗以小鼠C2C12 成肌細胞為研究對象，誘導細胞分化6 d構建骨骼肌再生模型，研究香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）對C2C12 成肌細胞肌再生能力的影響，同時觀察分化過程中CSE對C2C12成肌細胞分化能力、衰老的影響，探討CSE 抑制小鼠骨骼肌細胞再生的機制，為COPD合并肌少癥的發病機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 小鼠C2C12 成肌細胞購于中科院上海細胞庫。胎牛血清、馬血清、DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶、青－鏈霉素雙抗（Gibico 公司）；香煙（Marlboro 公司）；熒光定量擴增試劑盒（TAKARA 公司）；RNA 逆轉錄試劑盒（Promega 公司）；MyHC、MyoD、Myogenin 鼠單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；P53、P21、P16 兔單克隆抗體（Abcam）；β-actin兔單克隆抗體（武漢三鷹公司）；山羊抗兔熒光二抗（CST）。

1.2 CSE 的制備[5]連接驅動裝置上的注射器，去掉濾嘴，將兩支香煙固定于注射器的一端，慢慢抽吸注射器數次后，震蕩以使煙霧均勻溶于2 mL PBS中，制成CSE 懸液，經0.22 μm 濾膜過濾除菌，將CSE溶液稀釋至所需濃度用于后續實驗。

1.3 C2C12 成肌細胞培養及實驗分組[5]在5%CO2、37 ℃的培養箱中培養細胞，用含10%胎牛血清的高糖培養基培養增殖期的C2C12 成肌細胞，消化，離心，計數，接種相同細胞數的C2C12成肌細胞于培養皿中，待其鋪滿80%左右，更換成含2%馬血清的培養基誘導細胞分化。從分化開始的第1天加入CSE 進行干預，每隔2 d 換液一次，分化6 d 后即可形成骨骼肌細胞。收集分化3 d 和分化6 d 的細胞用于后續實驗。將未加入CSE 干預的細胞設為正常（N）組，加入CSE干預的細胞為CSE組。

1.4 細胞免疫熒光法鑒定骨骼肌細胞 將C2C12成肌細胞接種于24 孔板中，用2%馬血清誘導分化培養6d 后，用PBS 浸洗孔板細胞3 次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗3 次，3 min/次；0.5%Triton X-100(PBS 配制)室溫通透20 min；PBS浸洗3次，3 min/次；滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，不洗，MyHC 一抗（1∶200）置于4 ℃冰箱孵育過夜。第2 天，PBS 浸洗孔板3 次，3 min/次，滴加熒光二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，PBS 浸洗3 次，3 min/次；滴加DAPI 避光孵育5 min，對孔底細胞進行染核，PBS洗4次，5 min/次，洗去多余的DAPI；然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。MyHC表達陽性（胞質被染成紅色）表明該細胞是骨骼肌細胞，即C2C12成肌細胞成功分化為骨骼肌細胞。

1.5 Western blotting 法檢測MyHC、MyoD、Myogenin、P53、P21、P16 蛋白表達 收集培養皿的細胞，4 ℃離心，去掉上清后加入蛋白裂解液，30 min后再次離心吸取上清，BCA 法檢測蛋白濃度；SDSPAGE分離蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜，一抗孵育過夜（P53、P21、P16抗體的稀釋比為1∶1 000，MyHC、MyoD、Myogenin 抗體的稀釋比為1∶500）；洗膜，熒光二抗(1∶10 000)常溫孵育1 h，使用Odyssey紅外掃膜儀（LICOR公司）直接掃膜成像，顯示蛋白條帶。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 相對表達量 收集兩組細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，用熒光定量擴增試劑為上機（ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀）擴增做準備。MyHC4上游引物（上海生工生物工程有限公司合成）：5’-CAGACAGAGAGGAGCAGGAGAGTG-3’，下游引物：5’-TTGGTGTTGATGAGGCTGGTGTTC-3’；MyHC7 上游引物：5’-CAGAACACCAGCCTCATCAACCAG-3’，下游引物：5’-TTCTCCTCTGCGTTCCTACACTCC-3’。首先激活酶活性（95 ℃，10 min），然后按照變性（95 ℃，15 s）、退火和延伸（60 ℃，60 s）程序，共40 個循環。用2-△△Ct法計算MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件分析實驗數據，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌再生模型的鑒定 顯微鏡下可見處于增殖期的C2C12 成肌細胞呈單核、梭形（圖1A），誘導分化6 d 后，細胞融合形成含多個細胞核的肌管（圖1B），且經骨骼肌細胞標志物MyHC 抗體孵育后，細胞質被染成紅色（圖1C），表示C2C12 成肌細胞成功分化為骨骼肌細胞。

2.2 兩組MyHC mRNA 及蛋白表達比較 誘導分化6 d 后，與N 組比較，CSE 組MyHC 蛋白水平降低，MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 表達水平顯著下降（均P＜0.05），見圖2。

圖1 不同時期的C2C12成肌細胞形態及MyHC免疫熒光圖

圖2 兩組骨骼肌細胞MyHC蛋白表達及MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA表達比較

2.2 兩組細胞分化指標MyoD、Myogenin蛋白表達比較 誘導分化3 d 后，與N 組比較，CSE 組細胞中MyoD、Myogenin 蛋白表達水平明顯降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組MyoD、Myogenin蛋白表達比較

2.3 兩組細胞衰老指標P53、P21、P16表達比較 誘導分化3d后，與N組比較，CSE 組細胞中P53、P21、P16蛋白表達水平顯著升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 兩組P53、P21、P16蛋白表達比較

3 討論

機體內靜息狀態的衛星細胞具有骨骼肌再生能力，在應對外界因素（衰老、炎癥等）中為骨骼肌提供肌核和肌纖維，對損傷修復和維持肌肉完整性有著決定性的作用[6-7]。最新的研究發現，煙草煙霧暴露的小鼠和COPD合并肌少癥患者骨骼肌組織中靜息狀態的衛星細胞減少[8]，衛星細胞早衰及再生潛能耗盡可能是骨骼肌功能受損的原因[9]。本研究目的是通過體外復制CSE誘導下骨骼肌再生模型，探討CSE 對C2C12 成肌細胞分化成骨骼肌細胞中再生機制影響。

C2C12 成肌細胞具有自我增殖、定向分化為骨骼肌細胞能力，是體外研究肌肉再生的最佳模型。成肌細胞分化能力是骨骼肌細胞形成的關鍵，由肌源性調節因子（MRFs）的MyoD 家族調控分化步驟[10]。Myogenin 是MRFs 的一員，作用于MyoD 的下游，在推動成肌細胞分化的終末階段發揮這重要的作用[10-11]。本研究結果顯示，C2C12成肌細胞經誘導分化后變成肌管，分化后細胞的細胞質被染成紅色，含多核，表明這些細胞是成熟的骨骼肌細胞，提示本研究使用的體外骨骼肌細胞再生模型是成功的。CSE 暴露下，細胞MyHC 熒光強度明顯減弱；MyHC蛋白表達水平，I型骨骼肌纖維MyHC7、II型骨骼肌纖維MyHC4的mRNA水平顯著下降（均P＜0.05）。這些結果提示，CSE抑制C2C12成肌細胞再生能力，同時表現為I型骨骼肌纖維MyHC7、II型骨骼肌纖維MyHC4 表達減少，提示骨骼肌細胞的耐力、肌力明顯減弱。同時，進一步的研究結果顯示，CSE干預下，成肌細胞分化指標MyoD、Myogenin表達水平明顯降低（均P＜0.05），這提示CSE 抑制C2C12成肌細胞的分化能力。Sancho-Munoz等[8]研究發現，COPD患者骨骼肌衛星細胞數量減少，股外側肌MyoD、Myogenin 表達降低。在合并肌少癥的COPD患者的股外側肌檢測到靜息狀態的衛星細胞減少，激活的衛星細胞增多；嚴重的COPD患者無論是否并發肌少癥，激活的衛星細胞增多，觸發肌細胞再生過程。因此，結合本研究結果，可推測在COPD 患者中盡管觀察到激活的衛星細胞增多，然而激活的衛星細胞可能并未能分化成骨骼肌細胞，從而導致骨骼肌質量并未得到維持而是丟失。煙草煙霧調控骨骼肌再生能力值得進一步深入研究，為COPD合并肌少癥的治療及預防提供新的策略和參考。

研究認為，衰老與衛星細胞再生能力密切相關[12-13]。P53 與骨骼肌衰老、衛星細胞功能有關[14]。有研究證明，P53直接調控MyoD依賴性轉錄途徑，抑制Myogenin表達，調節成肌細胞分化[11]。最新的研究發現，P53 在調節衛星細胞分化和自我更新的平衡中發揮重要作用，這項研究指出P53 必須在成肌細胞退出細胞周期時快速返回到基礎水平，以便細胞發生分化；在未分化的成肌細胞中，p53水平持續增加抑制肌分化和促進細胞自我更新[15]。MyoD的激活誘導P21表達促進成肌細胞進入終末分化階段。相反，P21 誘導和MyoD 激活失偶聯抑制終末分化[16]。此外，靜息狀態的衛星細胞可由于P16 表達升高誘導細胞衰老，無法被激活而失去肌再生潛力[4]。研究發現，在肢體廢用誘導的骨骼肌萎縮模型中P53、P21 蛋白表達水平升高[17]，煙草煙霧暴露激活小鼠膈肌P53/P21 途徑，可能與膈肌萎縮相關[18]。由此可知，煙草煙霧抑制骨骼肌再生障礙的機制可能與細胞衰老有關。本研究結果發現，CSE暴露下，衰老因子P53、P21、P16 蛋白水平顯著增高（均P＜0.05），提示CSE 誘導細胞分化能力下降的同時伴有細胞衰老水平增加。CSE誘導P53蛋白水平升高，這與MyoD、Myogenin 蛋白水平降低的結果一致。同時，CSE也誘導P21蛋白水平升高，促進細胞退出細胞周期，但MyoD 蛋白表達下降，提示CSE 誘導C2C12 成肌細胞退出細胞周期但并未能成功進入分化時期。從這個角度理解可以解釋COPD 合并肌少癥患者骨骼肌激活衛星細胞增多，但骨骼肌再生能力減弱這一現象。此外，P16 蛋白水平增高可能是CSE 誘導C2C12 成肌細胞衰老失去定向分化能力的機制，這也從另一個角度說明，CSE誘導P53水平增加可促進細胞自我更新而肌再生能力降低這一看似矛盾的結果，可能是由于這些新生的成肌細胞失去分化能力。

綜上所述，香煙煙霧暴露下C2C12成肌細胞再生能力受到抑制，可能與CSE誘導細胞分化能力減弱、P53/P21信號途徑激活誘導細胞衰老有關。