多西環素對堿燒傷大鼠角膜中波形蛋白和纖維連接蛋白表達的影響*

陳 迪，譚少健，鄒文進

(廣西醫科大學第一附屬醫院眼科，南寧 530021)

眼部化學燒傷在各種場合均很常見，眼化學燒傷的發生率占所有眼外傷的7.7%～18.0%，并且堿性燒傷通常比酸性燒傷的發生率更高、危害更大[1]。角膜堿燒傷由于纖維化引起的角膜混濁而導致不可逆的視力喪失通常需要進行角膜移植以恢復視力，這仍然是一項巨大挑戰[2]。多西環素是一種四環素類抗生素，具有較強抗菌、抗炎及免疫調節的作用，在角膜堿燒傷模型中具有強大的抗炎及抑制新生血管作用[3]。本課題組之前的研究已經表明多西環素通過抑制TGF-β1及α-SMA的表達來減輕堿燒傷大鼠角膜混濁程度[4-5]，其具體抗纖維化機制還有待進一步的研究。近年來的研究表明，角膜創傷后基質細胞被激活產生大量細胞外基質（ECM）堆積在細胞間形成角膜混濁。波形蛋白(Vim)和纖維連接蛋白（Fn）被認為是成纖維細胞的標記物[6]，這種ECM蛋白是影響角膜纖維化的重要指標。因此，本次研究以大鼠角膜堿燒傷為模型，觀察多西環素對堿燒傷大鼠角膜中Vim 和Fn 表達的影響，探索多西環素抑制堿燒傷大鼠角膜纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SPF級SD大鼠54只，體重180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。實驗前所有大鼠均通過裂隙燈排查眼前節疾病。按隨機數字表法將大鼠分為對照組和多西環素組，每組27 只（27 眼），均以右眼為實驗眼。實驗遵循國家實驗動物管理保護條例，動物實驗已獲得動物倫理委員會的批準。

1.2 SD大鼠角膜堿燒傷模型的制備 堿燒傷模型制備前1 d 用5.0 g/L 妥布霉素眼液點眼4 次預防感染。按照4 mL/kg 體質量向腹腔內注射100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，丁卡因眼液滴眼行表面麻醉，棉簽擦干結膜囊內多余液體。自制堿燒傷模具：200 μL容積的槍頭距尾部15 mm處水平切去槍頭前端，用刀片小心將切口端外部削薄，在槍頭內填塞適量棉花，使槍頭切口端外露的棉花形成一個平整微凸面，松緊度適中，槍頭尾部用紙膠布封貼，高壓高溫滅菌備用。于模具內滴入200 μL 1 mol/LNaOH，將模具垂直放置于大鼠右側角膜中央25 s，迅速用20 mL生理鹽水沖洗燒傷區及結膜囊1 min，沖洗完畢后可見角膜中央有一圓形灰白色燒灼斑，直徑約4 mm。顯微鏡下觀察角膜基質層水腫、混濁且虹膜隱約可見。堿燒傷后立即給予眼液滴眼，多西環素組以1.0 g/L 多西環素（美國Sigma）點眼，對照組以眼液溶媒點眼，溶媒除不含多西環素外，其余成分均與多西環素眼液相同，4次/d，20 μL/次，至臨床觀察期結束，即堿燒傷后第14天。

1.3 角膜渾濁程度評分 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14天對各組大鼠角膜進行混濁程度評分。角膜混濁程度的評分參照Holland 等的標準[7]：0 分：角膜透明無混濁；1 分：角膜輕度混濁，虹膜紋理可見；2分：角膜混濁較重，虹膜紋理不清；3分：角膜混濁進一步加重，但可見瞳孔；4分：角膜完全混濁，看不清瞳孔。

1.4 炎癥細胞計數 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14天每組隨機選取4只大鼠處死，用無菌手術器械沿角膜緣快速取下角膜，4%中性甲醛固定、常規梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精－伊紅（HE）染色及中性樹膠封片。于400 倍鏡下（日本Olympus）記錄各時間點切片中角膜周邊部、中周部及角膜中央共5 個視野，通過Image J 軟件進行炎癥細胞計數。

1.5 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測角膜中Fn mRNA和Vim mRNA的表達 建模成功后，分別在角膜堿燒傷后第3、第7、第14 天每組隨機選取5 只大鼠處死，用無菌手術器械沿角膜緣快速取下角膜，將角膜組織于裝有裂解Buffer R1的1.5 mL離心管內進行勻漿，提取角膜組織總RNA（美國Axygen），進一步逆轉錄成cDNA 并進行qPCR 反應（日本TaKaRa）。qPCR 反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s；Fn、Vim 及β-actin 均為40 個循環。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司設計并合成，引物序列如下：Fn-F：5’-CCACCATCACTGGTCTGGAG-3’，Fn-R：5’-GGGTGTGGAAGGGTAACCAG-3’；Vim-F：5’-TGCGGCTGCGAGAAAAATTG-3’，Vim-R：5’-GGTCAAGACGTGCCAGAGAA-3’；β-actin-F：5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，β-actin-R：5’-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3’。

1.6 免疫熒光檢測 采用石蠟切片（5 μm）進行免疫熒光染色，抗原修復后用10%驢血清封閉30 min，加入Fn（1∶200）和Vim（1∶200）一抗（英國abcam），4 ℃冰箱孵育過夜，加入熒光二抗CY3 山羊抗兔（1∶300）/488 山羊抗小鼠（1：400）（武漢賽維爾生物）避光室溫孵育50 min，再加入DAPI染液復染細胞核，避光室溫孵育10 min，最后淬滅組織自發熒光后用封片。于200倍鏡下（日本Olympus）各時間點隨機選取3 個視野，采用Image J 軟件分別對Fn 及Vim的陽性熒光面積進行測量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所有實驗數據以均數±標準差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 角膜混濁程度評分 建模成功后第3、第7、第14 天在眼科顯微鏡下對各組大鼠進行活體觀察。角膜堿燒傷后第3天：兩組均表現為角膜上皮缺損、基質層水腫、混濁且虹膜紋理不清，兩組間角膜混濁程度評分比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。堿燒傷后第7 天：對照組角膜水腫較重、基質混濁，瞳孔隱約可見；多西環素組角膜水腫較輕，虹膜紋理不清；多西環素組角膜混濁程度輕于對照組(P＜0.05)。堿燒傷后第14天：對照組可見新生血管長入堿燒傷區，瞳孔不可見；多西環素組角膜基質水腫消退，角膜少量云翳，虹膜紋理清晰；多西環素組角膜混濁程度輕于對照組(P＜0.05)，見圖1、表1。

圖1 堿燒傷后各時間點兩組角膜混濁程度情況

表1 堿燒傷后各時間點兩組角膜混濁程度評分分，

表1 堿燒傷后各時間點兩組角膜混濁程度評分分，

與對照組比較，#P＜0.05。

2.2 角膜炎癥細胞計數 在第3、第7、第14 天，多西環素組角膜炎癥細胞數量均少于對照組（P＜0.05），見表2。角膜堿燒傷后第3天：兩組均表現為角膜上皮細胞水腫，2～3層細胞，基質層水腫且排列疏松，但多西環素組炎癥細胞較少。堿燒傷后第7天：對照組角膜上皮細胞稍水腫，4～6 層，基質層水腫明顯，纖維排列紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤；多西環素組角膜上皮細胞基本愈合，4～5層，基質層水腫較輕，纖維排列尚規則，可見少量炎癥細胞浸潤。堿燒傷后第14 天：對照組角膜上皮細胞4～6層，基質層仍可見水腫，纖維排列不規則，較多炎癥細胞浸潤；多西環素組角膜上皮完全修復，纖維排列規則，極少量炎癥細胞浸潤，見圖2。

表2 堿燒傷后各時間點兩組角膜炎癥細胞計數個，

表2 堿燒傷后各時間點兩組角膜炎癥細胞計數個，

與對照組比較，#P＜0.05。

圖2 堿燒傷后各時間點兩組角膜炎癥細胞變化（HE，×200）

2.3 免疫熒光染色 角膜堿燒傷后第3、第7、第14天分別對兩組大鼠角膜進行免疫熒光染色，紅色熒光代表Fn，綠色熒光代表Vim，藍色熒光代表細胞核。堿燒傷后第3、第7、第14 天多西環素組Fn 及Vim 的陽性熒光面積（Area%）均較對照組小（P＜0.05），見圖3。

2.4 Fn mRNA和Vim mRNA的相對表達情況角膜堿燒傷后第3、第7、第14天多西環素組Fn mRNA 和Vim 的mRNA 水平均較對照組低(P＜0.05)，見表3、表4。

圖3 堿燒傷后各時間點兩組角膜Fn及Vim免疫熒光強度（IF,×200）

表3 堿燒傷后各時間點兩組角膜中Fn mRNA相對表達量以及蛋白水平比較

表3 堿燒傷后各時間點兩組角膜中Fn mRNA相對表達量以及蛋白水平比較

與對照組比較，#P＜0.05。

表4 堿燒傷后各時間點兩組角膜中Vim mRNA相對表達量以及蛋白水平比較

表4 堿燒傷后各時間點兩組角膜中Vim mRNA相對表達量以及蛋白水平比較

與對照組相比，#P＜0.05。

3 討論

化學損傷引起角膜混濁的發病機制是復雜的分子信號事件級聯，涉及多種纖維化途徑和ECM的重塑[8]。目前大部分學者認為，當角膜受到創傷后，角膜基質細胞激活、增生、轉化，激活的基質細胞產生大量ECM堆積在細胞間，基質纖維排列紊亂形成角膜混濁。Vim 是角膜纖維化中必需的Ⅲ型中間絲，被認為是角膜纖維化的新靶標[9-10]，在角膜被堿性物質灼傷后，角膜基質細胞激活并遷移至堿燒傷區轉化成高表達Vim的肌成纖維細胞[11]。Bargagna-Mohan等[12]通過研究發現，阻斷Vim的表達，可以降低堿燒傷角膜的纖維化，從而提高角膜透明度。Das 等[13]在角膜創傷模型中也有類似的發現，敲除Vim 可以預防角膜纖維化。Fn 是一種存在于角膜基質層中的高分子糖蛋白，它的主要功能是連接細胞與基質以及細胞與細胞，在組織纖維化過程中起著重要作用。有研究表明，在大鼠角膜堿燒傷后Fn表達量急劇增加，它參與了堿燒傷角膜傷口的愈合過程[14]。Shi 等[15]發現，TGF-β1 可以通過JNK 信號途徑促進成纖維細胞中Fn的表達，最終導致角膜纖維化。因此，Fn的過度表達也可能是造成角膜纖維化的重要原因。陶丹等[16]的研究驗證了這一觀點，她發現減少ECM-FN 的表達可以減輕PKA 術后角膜基質混濁的程度。Vim 及Fn 作為角膜基質纖維化的新的標記物，阻斷其表達可能成為治療角膜基質混濁的新方法。

本次實驗用眼科顯微鏡對堿燒傷后角膜混濁程度評分并進行了統計學分析，實驗結果表明堿燒傷后第3 天兩組角膜混濁程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在堿燒傷后的第7 天和第14 天，多西環素組均比對照組的角膜混濁程度輕（P＜0.05）；堿燒傷后第14天，對照組角膜基質混濁，遮擋瞳孔，可見新生血管長入堿燒傷區，而多西環素組僅有少量角膜云翳，角膜幾乎恢復透明，表明多西環素可以有效減輕堿燒傷大鼠角膜的渾濁程度。

多西環素是四環素類抗生素，具有很強的抗炎和免疫調節的作用。多西環素還有一定的抗纖維化作用，其抗纖維化作用主要是通過抑制ECM的生成和重塑來實現的，對Fn及Vim的調節作用已有報道，它可以抑制呼吸道上皮細胞中TGF-β1 誘導的Vim、Fn 以及α-SMA 的表達，減輕鼻旁竇黏膜破壞后引起ECM沉積，最終抑制鼻息肉的形成[17-18]；可以作為肝細胞癌上皮－間充質轉化和血管生成擬態的抑制劑，通過抑制間質標記物-Vim的表達來延緩上皮－間充質轉換的進程，最終延長肝細胞癌小鼠的生命[19]；還可以抑制平滑肌細胞中ECM蛋白Vim和Fn 的表達來減輕動脈粥樣硬化[20]。本研究結果顯示，對照組在堿燒傷后第3天炎癥細胞開始增多，第7 天達到頂峰，第14 天時逐漸消退；對照組Fn 及Vim mRNA和蛋白質的表達量在堿燒傷后第3天的時候也已經開始表達增加，在第7天就達到峰值，隨后逐漸降低，與炎癥細胞浸潤的趨勢基本保持一致；筆者推測，Fn 及Vim 的表達與角膜炎癥反應可能存在一定的關系。多西環素組各時間點的炎癥細胞計數、Fn及Vim mRNA和蛋白質的表達量均較對照組輕（P＜0.05）。提示多西環素可降低Fn 及Vim 的表達，減少炎癥反應。本課題組之前的研究已經表明多西環素可以抑制堿燒傷大鼠角膜中NFκB、TGF-β1 及α-SMA 的表達，本次研究結果表明多西環素還可以抑制Fn 及Vim 的表達來減輕角膜纖維化，那么在堿燒傷模型中，Fn 及Vim 的表達是否與TGF-β1、NF-κB 的表達有關，它們之間存在何種聯系，有待我們進一步的研究。

綜上所述，多西環素可減輕大鼠角膜的渾濁程度，其可能通過減少ECM 蛋白Vim 及Fn 的沉積來減輕堿燒傷大鼠的角膜混濁程度。本次研究為角膜纖維化的機制和多西環素治療大鼠角膜堿燒傷提供了一定的依據和理論基礎。