紅霉素抑制煙草煙霧提取物誘導人巨噬細胞炎癥及其機制的研究*

霍健君，李梅華，馬 南，邱居烽，冷子楊，王紹霜，鐘小寧，何志義

(廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，南寧 530021)

煙草煙霧誘發肺部的炎癥被認為是慢性阻塞性肺疾病（COPD）發生發展的主要驅動機制之一。研究發現，COPD患者肺內巨噬細胞數量明顯增加，且其數量與疾病嚴重程度呈正相關關系[1]。巨噬細胞通過驅動炎癥的起始和消退在炎癥反應和先天免疫中發揮重要作用。當受到煙草煙霧刺激時，巨噬細胞可分泌相關炎癥介質[2]，如白細胞介素（IL）-8，參與機體的炎癥反應和免疫應答—涉及組蛋白去乙酰化酶（HDACs）和核因子（NF）-кB 的調控[3]。HDACs 被證實主要通過調節炎癥反應參與先天免疫[4]，其去乙酰化作用可加強DNA 與組蛋白的結合，并阻礙轉錄因子的活性[5]。有研究報道，I 型組蛋白去乙酰化酶（HDAC3）可通過阻礙NF-κB 核易位，抑制炎性基因的轉錄[6]。近年來研究證實，大環內酯類藥物對于中至重度穩定期和急性加重期的COPD 患者具有良好的治療效果[7-8]，是作為今后治療COPD 新藥的重要選擇之一[9]。有研究表明，大環內酯類藥物紅霉素（EM）具有獨特的抗炎活性，可以抑制煙草煙霧暴露所致的炎癥[10-11]。而目前關于EM抑制煙草煙霧提取物（CSE）誘導人巨噬細胞炎癥的具體機制仍未明確。本研究旨在通過探討EM 抑制CSE 誘導人巨噬細胞炎癥的作用，以期進一步認識EM抗炎的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人單核細胞株U937細胞購自中國科學院細胞庫。佛波脂（PMA）、EM、NF-κB特異性抑制吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）及HDACs 特異性抑制劑曲古霉素（TSA）購自美國Sigma公司。真龍牌過濾嘴香煙（焦油：15 mg，煙堿1.1 mg）購自廣西南寧卷煙廠。CCK-8 檢測試劑盒購自大連美侖生物公司；IL-8 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自美國R&D公司；DIG凝膠遷移率試劑盒購自瑞士Roche 公司；核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce 公司；HDAC3、NF-κB抗體分別購自美國Santa Crus、Cell Signaling Technology 公司。E-Gel Imager 凝膠成像系統購自賽默飛世爾科技有限公司；Odyssey 紅外熒光掃描成像系統出自美國Licor公司。

1.2 細胞培養及分化 將U937細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養基中，置于5%CO2、37 ℃干凈細胞培養箱中培養，每周進行2次傳代。將細胞以1×107個/孔的密度均勻接種于6孔板中，加入10 ng/mL PMA 誘導分化成巨噬細胞[12]，24 h后棄上清，更換新培養基。

1.3 CSE 的制備[13-14]將2 支點燃的去過濾嘴香煙連接于氣體收集裝置，用50 mL注射器連續抽吸，使煙草煙霧通入20 mL 無血清培養基中，調pH 值至7.4，0.22 μm 無菌濾器過濾，制成10% CSE 無菌溶液，稀釋至工作濃度，在1 h內使用。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力 將U937 細胞按1×104個/孔的密度接種于96 孔板中，誘導分化為巨噬細胞后，分別加入不同濃度CSE（0.5%、1%、2%）和EM（1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL）干 預24 h、48 h、72 h，各設置3 個復孔，棄上清，按照CCK-8 試劑盒說明書操作，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，以OD450值代表巨噬細胞活力，篩選最佳作用濃度及時間。

1.5 細胞上清液IL-8 檢測 收集對照組、CSE 組（1% CSE 刺激24 h 或48 h）、CSE+EM 組（EM 預孵育24 h 或48 h 后加1% CSE 刺激24 h）和CSE+PDTC 組（PDTC 預孵育24 h 或48 h 后加1%CSE 刺激24 h）細胞上清，1 000 r/min離心5 min，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測IL-8的濃度。

1.6 細胞轉錄因子NF-кB 活性的檢測 收集對照組、CSE 組（1%CSE 刺激24 h）、CSE+EM 組（EM 預孵育24 h 或48 h 后加1% CSE 刺激24 h）和CSE+PDTC組（PDTC預孵育24 h后加1%CSE刺激24 h）細胞，按核蛋白提取試劑盒說明書進行核蛋白提取，BCA 法檢測濃度，Invitrogen 公司合成NF-кB 探針并以地高辛（DIG）標記，按照凝膠遷移率阻滯實驗（EMSA）試劑盒說明書步驟進行探針蛋白結合實驗，化學發光成像系統曝光檢測NF-кB探針蛋白結合情況，以此代表其活性。

1.7 Western blotting法檢測HDAC3和NF-кB蛋白表達 收集對照組、CSE 組（1% CSE 刺激24 h）、CSE+EM組(EM預孵育24 h后加1%CSE刺激24 h）和TSA 組（TSA 孵育24 h）細胞，預冷PBS 洗滌，加RIPA 蛋白裂解液，離心，取上清測蛋白濃度，SDSPAGE 分離蛋白，轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST 洗膜，分別加入一抗HDAC3、NF-кB、β-Actin（均為1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜，加熒光二抗（1∶10 000）室溫下搖床避光孵育1 h，TBST 洗膜。Odyssey 紅外熒光掃描成像系統檢測目的蛋白條帶灰度值，Image J軟件分析目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用統計軟件SPSS 23.0對實驗數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CSE 及EM 對人巨噬細胞活力的影響 與對照組比較，2%CSE作用24 h、48 h、72 h后細胞活力明顯降低（P＜0.05），100 μg/mL EM 作用48 h、72 h 后細胞活力明顯降低（P＜0.05），其他濃度的CSE 及EM 在24 h、48 h、72 h 均未對巨噬細胞活力產生影響，見圖1。為使CSE 及EM 盡可能發揮各自作用并參考以往實驗結果[10]，本實驗選取終濃度為1% CSE 及1 μg/mL EM 作用24 h 或48 h 進行后續實驗。

圖1 不同濃度CSE及EM對巨噬細胞活力的影響

2.2 各組細胞上清中IL-8 濃度比較 與對照組比較，1%CSE 刺激24 h 或48 h 后細胞培養上清液中的IL-8 濃度均顯著增高（P＜0.05），而EM 和PDTC預孵育24或48 h均能明顯抑制用1%CSE刺激24 h對巨噬細胞IL-8表達的上調作用（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組細胞轉錄因子NF-κB活性比較 與對照組比較，CSE組轉錄因子NF-кB活性顯著增強（P＜0.05）；與CSE組比較，EM（預孵育24 h或48 h）以及PDTC可明顯抑制CSE對人巨噬細胞NF-кB的激活作用（P＜0.05），其中EM預孵育48 h較24 h的抑制作用更明顯，見圖3。

2.4 各組細胞HDAC3蛋白表達水平比較 與對照組比較，CSE 組和TSA 組HDAC3 蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）；與CSE 組比較，CSE+EM 組HDAC3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

2.5 各組細胞NF-кB 蛋白表達水平比較 與對照組比較，CSE組和TSA組NF-кB蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)；與CSE 組相比，CSE+EM 組NF-кB蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05)，見圖5。

圖2 各組細胞上清中IL-8含量比較

圖3 各組細胞轉錄因子NF-κB活性比較

圖4 各組細胞HDAC3蛋白表達水平比較

圖5 各組細胞NF-кB蛋白表達水平比較

3 討論

炎癥反應促進COPD 的發生發展，而吸煙是COPD 的主要致病因素[15]。既往研究發現，大環內酯類藥物可以通過調控激活蛋白（AP）-1、NF-кB、細胞外調節蛋白激酶（ERK）等信號，減少各類促炎因子、趨化因子及粘附分子的產生，抑制氣道中性粒細胞和巨噬細胞聚集，從而發揮抗炎作用[16-17]。本研究結果顯示，EM與NF-кB特異性抑制劑PDTC均能夠明顯抑制CSE 誘導的巨噬細胞炎癥介質IL-8的釋放，減輕炎癥，提示EM對CSE誘導的炎癥的抑制作用與PDTC類似，猜測EM有可能通過抑制NFкB途徑產生作用。

NF-кB對應于由其中兩個亞基RelA/p65和p50組成的異源二聚體，激活后易位到細胞核，與DNA結合并促進炎性基因的轉錄[6]。Wu 等[18]研究發現，IL-8 的釋放依賴于NF-кB 的激活。本研究結果顯示，EM能夠明顯抑制CSE刺激誘導的巨噬細胞NFкB轉錄活性增強，并且將EM預孵育時間從24 h延長至48 h 時，可觀察到抑制作用更明顯，猜測其作用可能存在時間依賴性。此外結合前面所述NF-кB特異性抑制劑PDTC 能夠抑制IL-8，提示了NF-кB參與了IL-8 的轉錄調控，進一步證實EM 抑制IL-8的釋放能夠通過抑制NF-кB活性實現的，從而發揮抑制與CSE相關的炎癥的作用。

HDAC3 屬于I 型HDACs，參與調控染色質重構、細胞增殖和炎癥基因表達[3,19]，發揮去乙酰化作用，促使NF-кB亞基RelA/p65與IκBα結合形成出核復合體，阻礙了NF-кB對炎性基因轉錄的激活[6]；換而言之，HDAC3 去乙酰化RelA/p65 的作用控制著NF-кB 的激活和核易位。本研究結果顯示，CSE 能夠降低巨噬細胞HDAC3 的表達，同時升高NF-кB的表達，與HDACs特異性抑制劑TSA比較，差異不具有統計學意義，提示HDAC3 途徑參與調控NFкB，說明了CSE 可以通過抑制HDAC3，從而激活NF-кB。此外本研究結果顯示，EM 能夠上調HDAC3 的表達，表明EM 抑制NF-кB 的活性，與活化HDAC3有關，揭示了EM抑制CSE誘導炎癥的可能途徑。近期在小鼠骨骼肌C2C12 細胞中，與HDAC3 同屬于I 型HDACs 的HDAC2 被證實介導CSE誘導的炎癥因子的釋放[20]。但EM是否確切通過HDAC3介導CSE誘導的巨噬細胞炎癥因子的釋放還需更深入的探究。

綜上，EM 能夠抑制CSE 誘導的炎癥介質IL-8的釋放，其抗炎作用與抑制NF-кB活性和表達及上調HDAC3表達有關。