罕見缺失型α-珠蛋白基因突變導致α-地中海貧血Hb H病*

何恩怡，李樹全，肖 璇，李汶蔚，陳 萍△

（1.中國醫學科學院地中海貧血防治研究重點實驗室，南寧 530021；2.廣西地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021）

α-地中海貧血是一種單基因疾病，其分子基礎是位于16 號染色體（16p13.3）上的α-珠蛋白基因簇異常導致α-珠蛋白鏈生成減少或缺如[1]。中間型α-地中海貧血的血紅蛋白H?。℉b H?。?，是一條染色體上的HBA2和HBA1基因同時缺失以及另一條染色體上的HBA2 或HBA1 基因缺失或點突變，分別導致缺失型和非缺失型Hb H病。在中國人群中，常見的缺失型α-地中海貧血基因突變主要是東南亞缺失（--SEA）、右側缺失（-α3.7）和左側缺失（-α4.2），常見的非缺失型α-地中海貧血基因突變是Hb Constant Spring（Hb CS）、Hb Quong Sze（Hb QS）和Hb Westmead（Hb WS）[2-3]。目前報道的Hb H病大多數是由于上述這些常見的基因突變導致的，但也有一些罕見基因突變的Hb H病應用常規方法未能檢測，在臨床上容易漏診或誤診。本研究報道一種罕見的缺失型α-地中海貧血基因突變導致Hb H 病的臨床和實驗室特征，為臨床診療和遺傳咨詢提供依據和指導。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2020 年5 月至2021 年2 月在廣西醫科大學第一附屬醫院就診、經Hb 分析確診為Hb H 病的88例患者為研究對象，其中男39例，女49例。在88例病例中檢測出3 例攜帶-α27.6缺失型突變的患者。3 例均來自廣西壯族自治區，中度貧血，無肝脾腫大，無輸血史。病例1為11個月大的女嬰，病例2為44歲的女性，病例3為10歲男童。

1.2 血常規分析

抽取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸枸櫞酸葡萄糖抗凝，采用血細胞自動分析儀（CELLDYN1700，雅培公司，美國）檢測紅細胞（RBC）計數、血紅蛋白（Hb）含量、紅細胞平均容積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血細胞比容（HCT）、紅細胞體積分布寬度（RDW）。

1.3 Hb分析

采用高效液相色譜儀(Hb Variant Ⅱ,伯樂公司，美國)對Hb H、Hb A2、Hb F進行定量分析。

1.4 DNA提取

取500 μL 全血，采用核酸自動提取儀（Lab-Aid 820，廈門百維信生物科技有限公司）提取DNA，按照試劑盒(Lab-Aid 820 核酸提取Midi 試劑，廈門致善生物科技股份有限公司)說明書操作。取1 μL DNA 樣本用紫外分光光度計（Nanodrop 2000/2000CC，賽默飛公司，美國）測定DNA濃度和純度。

1.5 α-地中海貧血基因突變分析

1.5.1 缺失型基因突變分析 采用跨越斷裂點PCR（Gap-PCR）檢測α-地貧常見的4 種缺失型基因突變，包括--SEA、--α3.7、--α4.2、--THAI（缺失型α-地中海貧血基因診斷試劑盒，深圳市億立方生物技術有限公司）。PCR 擴增：取4 μL DNA 樣本加入21 μL PCR反應液中。PCR反應條件：50 ℃預熱5 min，96 ℃預變性5 min；98 ℃變性45 s，64 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共35 個循環；72 ℃繼續延伸10 min（Veriti96型，賽默飛科技公司，美國）。電泳：配制1.2%的瓊脂糖凝膠，取5 μL 擴增產物加入凝膠孔，同時用5 μL 的DL2000 作為DNA Marker，在5V/cm 電壓下電泳60 min，置于凝膠成像系統（GeldocXR+，伯樂公司，美國）上觀察、拍照。

1.5.2 非缺失型基因突變分析 應用熒光PCR 熔解曲線法（FCMA）檢測α-地貧常見的3種非缺失型基因突變，包括Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突變（非缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒，廈門致善生物科技股份有限公司）。取n×19.8 μL PCR反應液、n×0.2 μL酶混合液放入1.5 mL離心管中，振蕩混勻后瞬時離心，分別以每管20 μL 分裝于PCR 反應管中，再加入5 μL DNA 樣本，混勻后放入PCR 儀。PCR 反應程序：50 ℃UNG 酶處理2 min，95 ℃預變性10 min；降落循環程序（10 個循環），95 ℃30 s，70 ℃15 s（每個循環下降1 ℃），76 ℃20 s；PCR循環程序（50 個循環），95 ℃15 s，55 ℃15 s，76 ℃20 s。熔解曲線分析程序：95 ℃1 min，35 ℃3 min，40 ℃～85 ℃（每0.4 ℃采集通道熒光信號）。

1.5.3 α-珠蛋白基因測序 應用二代測序技術對未檢測出上述基因突變的樣本進行檢測（華大基因公司），檢測結果與正常的α-珠蛋白基因序列進行對比。

2 結果

2.1 血常規、血紅蛋白分析及α-地中海貧血基因突變檢測結果

3例均表現為中度小細胞低色素貧血，Hb 平均值為76.8 g/L，MCV、MCH和MCHC均下降。無黃疸、肝脾腫大和輸血史。血紅蛋白分析結果顯示，3 病例均有Hb Bart’s 和Hb H，依次為Hb Bart’s 7%，Hb H 4%和Hb H 3%，見表1。

3例病例的α-地中海貧血缺失型基因檢測均發現有--SEA 缺失突變，未檢出其他缺失型基因突變。3例病例及對照病例的Gap-PCR產物電泳結果見圖1，3例病例的電泳結果無正常擴增條帶。非缺失型基因檢測未發現攜帶Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突變。

表1 血常規、血紅蛋白分析及基因檢測結果

圖1 缺失型α-地中海貧血Gap-PCR檢測結果

2.2 高通量測序結果

高通量測序結果顯示，在3 例病例中檢測到α-珠蛋白基因簇的9 079～36 718 bp 之間缺失，缺失長度共27 640 bp（NG_000006.1:g.9079_36718del27640），包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2基因，α1 基因未受影響。同時，在3 例病例中均檢出--SEA缺失型突變。

3 討論

近年來國內、外陸續報道一些罕見缺失型突變導致α+-地中海貧血，在中國人群中發現的有-α2.4、-α2.7、-α6.3、-α6.9、-α21.9、-α27.6等缺失型突變，國外報道的包括-α3.5、-αMAL3.5、α（α）5.3、-α7.9、-α16.6[4-6]等缺失型突變。

上述突變中包含了α2-珠蛋白基因缺失，但未影響α1-珠蛋白基因并導致Hb H病的突變有-αMAL3.5（NG_000006.1:g.32745_36301del3557）、-α6.9（NG-000006.1:g.29785-36746 del6962bp）、-α21.9（NG_000006.1:g.14373_36299del21927）及-α27.6（NG_000006.1:g.9079_36718del27640）等缺失。2015 年Abdul 等[7]首次在馬來西亞華裔發現-αMAL3.5缺失突變，之后Zhao等[5]在廣東省一個家系中也發現了該突變，其復合--SEA缺失突變時導致Hb H病。報道的5 例Hb H 病患者中，有1 例表現為輕度貧血（Hb 96 g/L，MCV 51.3 fL，MCH 15.2 pg），其余均為中度貧血（Hb 79～81.2 g/L，MCV 53.2～60.6 fL，MCH 13.4～19.8 pg）。其雜合子無貧血，僅MCV、MCH 接近正常值下限。2019 年，Zhuang 等[8]報道了福建省一個家系的-α6.9缺失突變，復合--SEA缺失突變時導致Hb H 病，表現為輕度小細胞低色素貧血（Hb 111 g/L，MCV 65.8 fL，MCH 21 pg），無黃疸及肝脾腫大。2013 年，Long 等[9-10]和Pang 等[11]在廣西省欽州市發現-α21.9缺失突變的存在。復合--SEA缺失突變時導致Hb H病，有中度小細胞低色素貧血（患者1：Hb 77 g/L，MCV 49.5 fL，MCH 15.4 pg；患者2：Hb 71 g/L，MCV 44.3 fL，MCH 12.9 pg），無黃疸；其雜合子僅各項血液學指標接近正常值下限（Hb 126 g/L，MCV 84.3 fL，MCH 26.2 pg）；復合-α2.4缺失突變和Hb CS 時，表現為輕度貧血（患者1：Hb 113 g/L，MCV 67.1 fL，MCH 21.6 pg；患者2：Hb 103 g/L，MCV 74.6 fL，MCH 24.3 pg）。

關于-α27.6缺失型突變，已有的病例均在福建省內發現。Wei 等[12]首次發現由-α27.6缺失突變復合--SEA的Hb H 病，-α27.6缺失范圍在α-珠蛋白基因簇上的9079～36718bp 之間，并插入了6 個核苷酸（AATCCC）。缺失包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2 基因，α1 基因未受影響。該患兒為中度貧血（Hb 79 g/L，MCV 54.1 fL，MCH 13.7 pg），Hb 分析顯示：Hb A21.7%，Hb F 1.9%。之后Wang等[13]報道了1例由-α27.6/--SEA導致的Hb H病，患者為中度貧血（Hb 83 g/L，MCV 53.2 fL，MCH 13.4 pg），92%的RBC 中發現了Hb H 包涵體。2018 年，Huang 等[14]報道了3 例-α27.6缺失突變復合--SEA的Hb H 病，3 例均表現為小細胞低色素貧血，未檢測到Hb H。其中先證者1 為輕度貧血（Hb 96 g/L，MCV 51.3 fL，MCH 15.2 pg），Hb分析顯示Hb A21.5%；先證者2 為中度貧血（Hb 81.2 g/L，MCV 53.2 fL，MCH 19.8 pg），Hb 分析顯示Hb A21.6%；先證者3為中度貧血（Hb 78 g/L，MCV 60.6 fL，MCH 16.7 pg），Hb分析顯示Hb A21.5%。上述患者均無黃疸、肝脾腫大，無輸血史。上述5 例-α27.6/--SEA基因型的Hb H 病大多數為中度貧血，Hb 分析顯示Hb A2降低，但未檢出Hb H或Hb Bart’s。

本研究檢測到3 例-α27.6缺失突變復合--SEA缺失突變的Hb H 病，均有中度貧血，與上述報道相似。但上述5 個病例中有1 例為輕度貧血，因而該類型基因突變與Hb H 病臨床貧血的輕重程度的關系有待更多的病例分析。

本文病例均在Hb 分析中檢測出Hb Bart’s 和Hb H。Hb Bart’s 為7%，Hb H 3%～4%，符合Hb H病的Hb分析特征。Hb H病的基因突變導致α-珠蛋白肽鏈生成減少，多余的β-珠蛋白肽鏈聚合成四聚體（Hb H）及γ-珠蛋白肽鏈聚合成γ 四聚體（Hb Bart’s），因而在Hb 分析中可檢測到Hb H（0.8%～40%），及少量的Hb Bart’s。本類型Hb H 病檢出的難度較大，較容易漏診或誤診。

本文首次在廣西地區發現-α27.6缺失突變導致的α-地中海貧血Hb H 病，有中度貧血，Hb 分析有Hb Bart’s 和Hb H。-α27.6缺失突變較為罕見，臨床上容易漏診。本文研究為α-地中海貧血的遺傳咨詢和臨床診療提供了依據和指導。