長壽及冠心病人群miR-27a-3p血清表達水平的狀況分析*

邱蘭蘭，陳 晶，彭均華，潘尚領

（廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，南寧 530021）

衰老是指伴隨著年齡增長而產生的一系列生理和解剖學方面的變化，也是人體對內環(huán)境和外環(huán)境適應能力逐漸減退的表現(xiàn)，是生物體在生命后期階段出現(xiàn)的全身性、進行性、多因素共同作用循序漸進的退化過程[1]。衰老是許多疾病的主要危險因素，包括神經退行性疾病、心腦血管疾病和腫瘤等[2]。我國人口老齡化日益嚴峻，預計到2050年，中國老年人口將達到4.8 億，屆時將占亞洲老年人口的四分之一[3]。老年人口的驟增將給醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)帶來巨大壓力，因此迫切需要致力于衰老問題的相關研究，探討老年相關性疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找老年相關性疾病治療靶點。

冠狀動脈心臟病（coronary heart disease,CHD）又稱冠狀動脈疾病（coronary artery disease,CAD），是最常見的老年相關性疾病，也是全球成人發(fā)病率和死亡率的主要原因[4-5]，嚴重影響人類的壽限。老年、吸煙、高血壓、低密度脂蛋白（LDL）水平高、高膽固醇和脂肪、糖尿病、肥胖等都會導致冠心病[6-7]。

MicroRNAs (miRNAs)是一種大小為19～25 個核苷酸的一類非編碼RNA分子，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種基因表達的轉錄后調控因子，通過與補體靶mRNA 結合，導致mRNA 翻譯抑制或降解，在細胞分化、增殖和存活中發(fā)揮核心作用[8]。miRNAs可作為包括癌癥、心血管疾病在內的許多疾病的診斷生物標志物[9-10]。有研究表明，miR-27a 和miR-329 表達水平與小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成有關[11-13]。另有研究提示，EIF4A3 誘導的circ-BNIP3 通過靶向miR-27a-3p/BNIP3 加重心肌細胞缺氧損傷[14]。但miR-27a-3p 與長壽以及冠心病的關系及其如何影響機體壽限尚不清楚。本文旨在研究miR-27a-3p與長壽以及冠心病的關系及其影響機體壽限的可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 長壽人群樣本來源于本課題組2014 年構建的紅水河流域長壽群體樣本庫。本次研究共抽取紅水河流域樣本庫246 例作為研究對象，其中長壽組95 例，年齡范圍為90～102 歲，平均（93.48±3.18）歲；老年組48 例，年齡65～84 歲，平均（75.15±4.27）歲；年輕組103例，年齡19～60歲，平均（48.48±9.18）歲。自述無重大疾病，生活可自理。冠心病患者及健康對照組樣本來源于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院。其中冠心病患者共135 例，年齡為46～90 歲，平均（63.89±11.67）歲；健康對照組共126 例，年齡50～85 歲，平均（60.59±8.79）歲。冠心病納入標準：（1）經冠狀動脈造影術診斷冠脈中重度狹窄；（2）具有心電圖心肌缺血的表現(xiàn)，如ST段抬高等；（3）符合《2018 版冠心病診斷與治療指南》的診斷標準；（4）具備正常的認知與溝通能力，自愿參與本項研究。排除標準：（1）合并嚴重肝腎功能不全；（2）合并惡性腫瘤、血液疾病、自身免疫性疾病等；（3）合并有精神障礙性疾病。本研究已獲得廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 流行病學資料 收集研究對象的身高、體重、血壓等常規(guī)數(shù)據，并進行問診和體格檢查，初步排除健康對照組老年相關性疾病。

1.1.3 血液樣本 研究對象空腹12 h以上，于次日清晨采集外周靜脈血8 mL，其中5 mL 為非抗凝處理，采血后在室溫靜置30 min，3 000 g離心5 min后分離血清，部分用于檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG）、高密度脂蛋白（HDL）、LDL、C反應蛋白（CRP）等臨床指標，部分用來提取總RNA并儲存于-80 ℃超低溫冰箱內備用，剩余部分血清于-80 ℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩Ａ硗? mL血液用ACD 抗凝處理后于-20 ℃凍存?zhèn)溆茫糜诨蚪MDNA提取。

1.1.4 主要試劑和儀器 血清FBG 水平使用日立7170 全自動生化分析儀進行檢測；血脂水平采用“申能試劑”標準酶試劑盒提供的酶法檢測；HDL和LDL采用酶聯(lián)免疫一步法檢測；血清總RNA提取試劑盒為Magen Hipure Liquid RNA Mini Kit；miRNA逆轉錄試劑盒購自于Sangon Biotech，包含2×miRNA RT Solution Mix 40 μL，miRNA RT Enzyme Mix 20 μL；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑為2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix；無水乙醇購自于成都科隆化學品有限公司；異丙醇購自于天津市富宇精細化工有限公司；引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；熒光實時定量PCR 儀為羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 qPCR法檢測血清miR-27a-3p相對表達量利用Magen Hipure Liquid RNA Mini Kit（R4163-03）試劑盒提取血清總RNA，按試劑盒說明書步驟進行裂解、沉淀、洗滌、洗脫RNA，最后將洗脫的RNA 逆轉錄為cDNA。使用生工miRNA 逆轉錄試劑盒（B532431）將總RNA 逆轉錄成cDNA，步驟如下：200 μL PCR 管中加入2×miRNA RT Solution Mix 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，總RNA 2 μg，后加RNase-Free Water 定容體積至20 μL，用移液器輕柔混勻后，PCR 儀中37 ℃60 min，85 ℃5 min條件下進行逆轉錄反應，逆轉錄產物進行后續(xù)qPCR 實驗。使用加尾法設計miR-27a-3p引物，上游引物：5’-AGTGGCTAAGTTCCGCAA-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；以U6 snRNA 為內參，上游引物序列：5’-CAGCACATAT-ACTAAAATTGGAACG-3’，下游引物序列：5’-ACGAAT-TTGCGTGTCATCC-3’。qPCR 反應體系為20 μL，反應條件為95 ℃3 min，擴增1 個循環(huán)，95 ℃15 s，擴增40 個循環(huán)，60 ℃20 s，擴增40 個循環(huán)，72 ℃10 s，40 個循環(huán)，95 ℃5 s，1 個循環(huán)，60 ℃60 s，1 個循環(huán)，95 ℃1 s，1 個循環(huán)。采用2-△△Ct方法計算miR-27a-3p 的相對表達水平。

1.2.2 觀察指標 收集并觀察研究對象的臨床生化指標。血清FBG 使用日立7170 全自動生化分析儀進行檢測；TC、TG、HDL、LDL 等血脂水平采用“申能試劑”標準酶試劑盒提供的酶法和酶聯(lián)免疫一步法檢測；CRP采用免疫層析法進行檢測；載脂蛋白A（Apo A）、載脂蛋白B（Apo B）采用免疫比濁法進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差()表示，多組均數(shù)比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗；偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（QR）］表示，不同分組之間采用多獨立樣本非參數(shù)檢驗，相關關系采用Spearman相關分析；計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅水河流域人群相關資料分析

長壽組、老年組及年輕組年齡分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。老年組TC、HDL、LDL、FBG、Apo A、Apo B 及體重指數(shù)（Ibm）等比長壽組高（均P＜0.05）；老年組收縮壓（SBP）比年輕組高（P＜0.05），而與長壽組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；三組CRP 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 血清miR-27a-3p 在紅水河流域人群中的表達水平

相對于老年組，miR-27a-3p 在年輕組及長壽組血清中表達量明顯上調（P＜0.05）。各組miR-27a-3p的表達水平在性別中比較（P＞0.05），見表2。

2.3 血清miR-27a-3p 與紅水河流域人群各臨床參數(shù)的關系

血清miR-27a-3p 表達水平與FBG、SBP、Ibm、CRP、Apo A 及Apo B 呈負相關關系（P＜0.05），與DBP、HDL、LDL、TC、TG無相關關系（P＞0.05），見圖1。長壽組中，血清miR-27a-3p表達水平與SBP、DBP、Ibm、CRP 及Apo B 呈負相關關系（P＜0.05），與FBG、HDL、LDL、TC、TG、Apo A 無相關關系（P＞0.05），見圖2；在老年組中，血清miR-27a-3p 表達水平與DBP、CRP 呈負相關關系（P＜0.05），與Ibm、FBG、SBP、HDL、LDL、TC、TG、Apo A、Apo B無相關關系（P＞0.05），見圖3。在年輕組中，血清miR-27a-3p 表達水平與CRP 及Apo B 呈負相關關系（P＜0.05），與Ibm、FBG、SBP、DBP、HDL、LDL、TC、TG、Apo A無相關關系（P＞0.05），見圖4。

表1 紅水河流域人群相關資料分析結果

表1 紅水河流域人群相關資料分析結果

與老年組比較，▲P＜0.05；與年輕組比較，*P＜0.05。

表2 各組血清miR-27a-3p表達量M（QR）

圖1 血清miR-27a-3p與Ibm、FBG、SBP、CRP、Apo A、Apo B的關系（整體）

圖2 血清miR-27a-3p與Ibm、SBP、DBP、CRP、Apo B的關系（長壽組）

圖3 血清miR-27a-3p與DBP、CRP的關系（老年組）

圖4 血清miR-27a-3p與Apo B、CRP的關系（年輕組）

2.4 miR-27a-3p在冠心病患者血中表達水平

qPCR法檢測冠心病患者及健康對照組中miR-27a-3p的表達水平，相對于健康對照組，miR-27a-3p表達水平在冠心病患者血清中下調（P＜0.05），見圖5。

圖5 冠心病患者血中miR-27a-3p表達水平

3 討論

冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變最常見的類型，而內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的早期標志。大量研究表明，miRNA在動脈粥樣硬化和介導細胞間通訊中起重要作用。Lovren 等[15]發(fā)現(xiàn)，剪切力刺激的KLF2介導的人臍靜脈內皮細胞分泌的外泌體富集在miR-143/145 中，控制平滑肌靶細胞基因的表達。且有研究證明，間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的外泌體miRNA 具有抗動脈粥樣硬化的作用。Li等[16]通過喂養(yǎng)小鼠以高脂飲食，并在小鼠模型中靜脈注射MSCs 外泌體12周后發(fā)現(xiàn)，MSCs 分泌的miR-let7 通過IGFZBP1/PTEN通路抑制巨噬細胞的浸潤，通過HMGA2/NFκB通路促進M2細胞的極化。MSCs外泌體減少了小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積，大大減少了巨噬細胞對板塊的浸潤。Xing等[17]也發(fā)現(xiàn)脂肪來源的MSCs的外泌體miR-342-5p 對內皮細胞具有抗動脈粥樣硬化作用。He 等[18]發(fā)現(xiàn)用氧化LDL 處理細胞會導致內皮細胞中外泌體miR-155水平的提高，miR-155可使巨噬細胞向M2 細胞極化，從而抑制炎癥反應。此外，Chang 等[19]發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化損傷過程中外泌體miR-92a 的釋放增加。MiR-92a 在局部微環(huán)境中被巨噬細胞吸收，通過靶向調控KLF4 激活巨噬細胞，參與動脈粥樣硬化斑塊的形成。

以上研究表明，miRNA與冠心病等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。而年齡是冠心病明確的獨立危險因素[20]，說明miRNA可通過影響冠心病的發(fā)生進而影響機體壽限。本研究發(fā)現(xiàn)，紅水河流域一般老年人血清miR-27a-3p 的表達水平低于長壽組和年輕組（P＜0.05），而長壽人群的血清miR-27a-3p表達水平與年輕對照人群相當，且miR-27a-3p表達水平在冠心病患者血清中下調（P＜0.05）。進一步分析miR-27a-3p 表達水平與冠心病危險因素相關關系時發(fā)現(xiàn)，在年輕組中，miR-27a-3p 表達水平與TG、TC、Ibm、LDL、SBP、DBP 等冠心病危險因素均無相關關系（P＞0.05），符合冠心病在年輕人群中發(fā)病率低的相關現(xiàn)狀；而在年齡大于90歲的長壽群體中，miR-27a-3p 表達水平與SBP、DBP、Ibm、Apo B及CRP 等冠心病危險因素呈負相關關系（P＜0.05）。基于以上關于miRNA與冠心病相關的機制研究，筆者猜測，miR-27a-3p 可能通過靶向抑制相關轉錄本的翻譯，保護內皮細胞功能，降低冠心病的發(fā)生率進而影響機體壽限。

綜上所述，miR-27a-3p 在長壽人群血清中表達水平高于普通老年人群，在冠心病患者中低表達，且與多種冠心病危險因素呈負相關關系，提示miR-27a-3p通過參與某種調控機制影響冠心病的發(fā)生并最終影響機體壽限。