miR-34a、HMGB1及PCNA在宮頸上皮內病變中的表達及其臨床意義*

萬 兵，梁月娟，王 鶴

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，南寧 530021）

宮頸癌（cervical cancer，CC）在全球女性診斷出的惡性腫瘤中居于第4位[1]，嚴重危害著廣大女性的健康。高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）持續感染是CC 發生的最主要危險因素[2]，但并非都會發展成宮頸上皮內病變（squamous intraepithelial lesions，SIL）甚至CC。其他致病機制是近年來的研究熱點，為SIL及CC的防治提供新思路。MicroRNA是一類高度保守的非編碼RNA，其可結合到靶mRNA的3’-UTR，并與其他輔助蛋白降解靶mRNA 轉錄本/抑制其翻譯成蛋白質[3]。MicroRNA 也可以作為原癌基因或抑癌基因參與癌癥的發生發展[4]。miR-34家族中有miR-34a、miR-34b和miR-34c，參與p53調控途徑[5]。miR-34a可調節細胞周期E2、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6、E2F轉錄因子、B淋巴細胞瘤2等蛋白[6]，并在CC[7]等腫瘤上發現其具有抗腫瘤活性，預測其可能是癌癥診斷和治療的潛在靶標。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-B1，HMGB1）是一種結合在DNA上高度保守的核蛋白，其在細胞內外發揮不同作用。細胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于細胞核中，被公認為細胞增殖的標志蛋白。HMGB1 參與組織修復、抑制凋亡、促進腫瘤血管的生成及腫瘤轉移等，還可促進樹突狀細胞的成熟遷移和Th2 細胞的極化，引起免疫逃逸[8]。相關研究發現，HMGB1 是多種miRNA的直接靶標，PCNA和HMGB1的表達呈正相關關系[9-10]，但miR-34a 在調控SIL 進展及癌變的分子機制仍不清楚。本研究探討miR-34a、HMGB1 及PCNA基因在SIL組織中的表達及其與臨床病理因素的關系。

1 材料和方法

1.1 組織標本和病例的收集

收集廣西醫科大學附屬腫瘤醫院2016 年1 月至2019 年12 月收治的158 例SIL、宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）及因子宮肌瘤/子宮腺肌癥切除子宮的患者宮頸組織標本及臨床病理資料。將研究對象分為正常宮頸組（n=50）、SIL組（n=65）和SCC 組（n=43）。其中用于檢測miR-34a 的正常宮頸組31 例、SIL 組織30 例、SCC 組31例，用于檢測HMGB1、PCNA 的正常宮頸組38 例、SIL組52例、SCC組30例。所有標本取前患者均未行化療、放療及免疫治療。本研究獲得廣西醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準，所有患者及其家屬均已簽署知情同意書。

1.2 細胞培養

SCC 細胞系SiHa 細胞由復旦大學附屬上海市第五人民醫院饋贈，STR鑒定匹配值為100%。SiHa細胞在含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養基中培養。CC前細胞系H8細胞購自中國科學院，在含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素的1640培養基中培養，培養基、血清和抗生素均購自Gibco 公司。

1.3 RNA的抽提和實時熒光定量PCR（qPCR）

采用Trizol 法提取組織標本及細胞中的總RNA，并逆轉錄成cDNA，qPCR 檢測各基因表達，Trizol、逆轉錄及qPCR 試劑盒均購自Takara 公司。miR-34a 引物序列為5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’；U6上游引物為5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，下游為5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’；HMGB1 上游引物為5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，下游為5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’；PCNA上游引物為5’-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3’，下游為5’-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3’；GAPDH 上游引物為5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游為5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。上述引物均由Takara公司合成。每個樣品均檢測3次，U6 和GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCT計算各樣本中miR-34a 和細胞系中各基因的相對表達水平。HMGB1 和PCNA 基因在組織中的表達采用目的基因拷貝數/內參基因拷貝數進行統計學分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對數據進行分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，方差不齊時選用t’檢驗；非正態分布的計量資料采用中位數（四分位數間距）[M（QR）]表示，組間比較使用曼－惠尼特U檢驗。多組之間比較采用方差分析，方差不齊的組間比較采用秩和檢驗，計數資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理分析

3 組患者的年齡、孕次、絕經、HPV 感染情況比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。以年齡、絕經、孕次、產次、HPV感染為自變量，以診斷為SIL 及SCC 為因變量分別進行Logistic 單因素分析，結果顯示患者年齡、孕次及HPV 感染均與SIL有關（P＜0.05），年齡、絕經、孕次、產次及HPV感染均與SCC有關（P＜0.05）。同時，將年齡、絕經、孕次、產次、HPV 感染納入多因素分析，結果顯示，孕次是SIL 和SCC 發生的保護因素，而HPV 感染是SIL 和SCC發生的危險因素（P＜0.05），見表2、表3。

表1 不同組別患者的臨床病理分析

表2 影響SIL發生的危險因素的Logistic回歸分析

表3 影響SCC發生的危險因素的Logistic回歸分析

2.2 各組組織及細胞系中miR-34a、HMGB1 mRNA及PCNA mRNA的表達

2.2.1 miR-34a 的表達 miR-34a 在SIL組 和SCC組中的表達均顯著低于正常宮頸組（均P＜0.001），且在SCC 組顯著低于SIL 組（P=0.024）。在細胞系水平檢測結果顯示，miR-34a在H8細胞中的表達顯著高于SiHa細胞（P＜0.001），見表4。

表4 各組織和細胞中的miR-34a表達

2.2.2 HMGB1 mRNA 的表達 HMGB1 在正常宮頸組和SIL 組中的mRNA 表達均顯著低于SCC 組（P=0.001,P=0.038），且在正常宮頸組顯著低于SIL組（P=0.039）。HMGB1在H8細胞中的mRNA水平顯著低于SiHa細胞（P=0.005），見表5。

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2.2.3 PCNA mRNA的表達 PCNA在正常宮頸組和SIL組中的表達均顯著低于SCC組（P=0.033,P=0.004），但在正常組和SIL組差異無統計學意義（P=0.967）。PCNA 在H8 細胞中的mRNA 水平顯著低于SiHa細胞（P=0.045），見表6。

表5 各組織和細胞中的HMGB1表達

表6 各組織和細胞中的PCNA表達

2.3 不同臨床病理因素的患者miR-34a 表達的差異 miR-34a在HPV陽性的SIL和SCC組織中表達均較HPV 陰性者顯著下降（P=0.028，P=0.039），同時，有淋巴結轉移者miR-34a 表達顯著下調（P=0.015）。其余臨床病理因素與各組miR-34a 的相對表達量無明顯相關性，見表7、表8。

表7 患者臨床病理特征與miR-34a在正常組及SIL組中表達情況的關系M（QR）

表8 患者臨床病理特征與miR-34a在SIL組及SCC組中表達情況的關系M（QR）

3 討論

3.1 miR-34a表達與SIL的關系

SIL發展為宮頸原位癌、浸潤癌是一個多基因、多因素參與，經歷多階段的過程，而miRNA 在此過程中扮演著重要角色。miR-34a上游啟動子存在高度保守的p53 蛋白結合位點，還可通過靶向下調E2F3 表達在p53-miR-34a-E2F3-p53 通路和靶向SIRT1增強p53表達形成p53-miR-34a-SIRT1-p53正反饋通路增強miR-34a 的表達[11-12]，抑制細胞增殖，阻止細胞周期G1 期/S 期的轉變和促進細胞凋亡。Gocze等[7]發現miR-34a在CIN II～III中的表達水平顯著低于CINⅠ。同時miR-34a表達下調可促使肺癌[13]、乳腺癌[14]、CC[15]、前列腺癌[16]等腫瘤的發生。本研究發現，miR-34a 在SIL 和SCC 組織較正常宮頸組織表達均顯著下調（均P＜0.001），且SCC組顯著低于SIL組（P=0.024）。同時，miR-34a在H8細胞中的表達顯著高于SiHa 細胞（P＜0.001）。說明miR-34a在SIL和SCC組織中、H8和SiHa細胞中的表達趨勢是一致的，隨著宮頸病變程度加重，miR-34a表達逐漸降低。

3.2 HMGB1表達與SIL的關系

研究表明，HMGB1 是miR-34a 的直接靶標，參與腫瘤的發生發展[9-10]。Yu 等[17]發現HMGB1 在慢性宮頸炎患者與CINs 的陽性染色率均顯著低于浸潤性SCC，隨著宮頸病變的加重而表達升高。Pang等[8]發現HMGB1 的表達是隨著宮頸病變的進展而顯著性上升，與FIGO 分期、淋巴結轉移顯著相關。本研究結果與上述一致，HMGB1 在SCC 組中mRNA 水平均顯著高于正常宮頸組和SIL 組（P=0.001，P=0.038），且SCC 組顯著高于SIL 組（P=0.039）。HMGB1 在H8 細胞中mRNA 水平顯著低于SiHa 細胞（P=0.005）。說明HMGB1 在SIL 和SCC 組織中、H8 和SiHa 細胞中的表達趨勢是一致的，隨著宮頸病變程度的加重，HMGB1表達逐漸升高。

3.3 PCNA表達與SIL的關系

研究發現，PCNA 在Base excision repair通路中是HMGB1的下游分子，敲低HMGB1可抑制PCNA表達，抑制癌細胞的增殖、遷移及侵襲[18-20]。PCNA是細胞增殖的標志蛋白，在腫瘤中可作為反映增殖程度與判斷預后的重要指標。Wang 等[21]發現PCNA 在正常宮頸和炎癥性宮頸為陰性表達，在CIN組（63.2%）和SCC組（100%）中表達顯著增加，并預測PCNA 可能是CC 進展的臨床標志物。但Branca等[22]在正常宮頸中發現PCNA 的表達，認為不可將其作為CC 篩選的潛在指標，還發現上調PCNA 表達與HR-HPV 和CIN 進展密切相關，但不能預測CIN 治療后HR-HPV 的清除。本研究發現，PCNA在SCC組中的表達均顯著高于正常宮頸組和SIL組（P=0.033，P=0.004），但正常宮頸組和SIL 組中的PCNA表達比較，差異無統計學意義（P=0.967）。H8細胞中的mRNA 水平也顯著低于SiHa 細胞（P=0.045）。說明與HMGB1 的表達一致，PCNA 在SIL和SCC 組織、H8 和SiHa 細胞中的表達也是隨著宮頸病變程度的加重而逐漸升高的。

3.4 miR-34a表達與患者臨床病理特征的關系

本研究發現，相比HPV 陰性的SIL 及SCC 組織，HPV 陽性的組織中miR-34a 的表達顯著降低（P＜0.05）。Gocze等[7]報道miR-34a在CIN I進展為CIN Ⅱ～Ⅲ和CIN Ⅱ～Ⅲ進展為CC階段均與HPV16陽性顯著相關。Geng 等[11]發現HR-HPV 陽性的正常宮頸組織、CIN組織及CC組織中miR-34a均顯著下調，并向Hela 和SiHa 細胞轉染miR-34a，細胞活力和集落形成能力均顯著下降。同時，本研究還發現，有淋巴結轉移者miR-34a 表達顯著下調（P=0.015）。Wang等[23]研究發現miR-34a低表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及FIGO 分期相關，miR-34a低表達的患者預后較差，并預測miR-34a可作為CC診斷和預后的參考指標。

綜上所述，隨著宮頸病變程度的加重，miR-34a的表達逐漸降低，下調的miR-34a 調控HMGB1 表達的能力下降，HMGB1 表達的增強促進其下游分子PCNA表達升高，進一步促進細胞惡性增殖，抑制P53抑癌通路，促使細胞發生癌變和轉移。同時，H8細胞和SiHa細胞上驗證miR-34a、HMGB1和PCNA的表達趨勢與組織一致。miR-34a、HMGB1 及PCNA有望成為預警SIL進展的新靶標。