內生真菌對低磷脅迫下杉木酸性磷酸酶活性的影響

艾如波，徐彩瑤，吳承禎,4，洪 偉，李 鍵，洪 滔，謝安強*

(1.福建農林大學 林學院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態系統經營與過程重點實驗室，福建 福州 350002；3.南京大學 地理與海洋科學學院，江蘇 南京 210023；4.武夷學院，福建 南平 354300)

【研究意義】磷作為植物生長發育的必需元素之一，在人類賴以生存的生態系統中起著不可替代的作用[1]。相關研究指出，在大多數土壤中，由于Ca、Fe和Al化合物以及粘粒的大量存在，土壤磷的活性很低；又因活性磷在土壤中易被固定，植物對磷肥的利用率亦極低[2]。這說明，植物可吸收利用的土壤有效磷缺乏，但土壤中儲備著大量植物不能利用的磷，造成植物“遺傳學缺磷”，而不是“土壤學缺磷”[3]。植物磷高效利用的研究主要有形態學、生理學以及遺傳學3種機制[4-7]。植物內生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌被感染的宿主植物(至少是暫時)不表現出外在病癥的微生物。可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生[8]。內生真菌主要是由子囊菌及其無性型組成，也包括少數擔子菌和接合菌[9]。Carroll將內生菌定義為生活在地上部分、活的植物組織內并不引起明顯病害癥狀的真菌[10]。內生菌包括內生真菌(Endophyticfungi)和內生細菌(Endophyticbacteria)。內生真菌多樣性研究表明，植物內生菌幾乎存在于所有目前已研究過的植物中，分布廣，種類多，對松屬[11-13]、榿木屬[11]、桉屬[14-15]、冬青櫟屬[16]、山毛櫸屬[17]、紅豆杉屬[18]等已進行了廣泛的研究。內生真菌的研究主要集中在兩個方面：一是植物中的內生真菌對植物本身的影響，二是對植物內生真菌次生代謝產物的研究[19]。杉木(Cunninghamialanceolata)生長速率快、成材質量高[20]，屬我國南方人工林中常用樹種，也是南方經濟林的主要樹種。 【前人研究進展】近年來，由于營林管理和保護措施不規范，導致杉木林地生產力急劇下降，土壤地力衰退、營養缺乏，造成嚴重的生態和經濟損失。為解決這些問題，恢復土壤肥力，提高杉木人工林可持續生產力，我國學者從混交、輪栽、改善林地結構和微生物處理等展開研究[21]。在低磷脅迫下接種內生真菌對杉木生長和光合作用的影響研究較少。【本研究切入點】本文選取低磷脅迫下的杉木作為研究對象，通過實驗采集分析葉片、根系和土壤的酸性磷酸酶含量，并最終測定植株含磷量，分析內生真菌對杉木磷吸收的影響。【擬解決的關鍵科學問題】本研究為內生真菌提高植物抗逆性，促進生長和更加充分利用微生物和植物互作關系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

本試驗主要完成于福建農林大學的福建省高校森林生態系統過程與經營重點實驗室。東經118°08′～120°31′，北緯25°15′～26°39′，該地區的平均氣溫溫暖，一般為20～25 ℃，冬短夏長，約326 d的無霜期。年平均日照較長，高達1700～1980 h；年均降水量較大，約為900～2100 mm；年相對濕度約77%。此地常年受西伯利亞寒風和海陸氣溫差異的交替影響，形成夏季高溫多雨、冬季溫和少雨的氣候特征。

1.2 供試材料

本試驗進行土培盆栽試驗，試驗所用杉木幼苗為福建省林科院提供的半年生杉木組培苗。

1.3 試驗方法

選擇生長相同的杉木幼苗定植于直徑20 cm，高15 cm的塑料盆中，土盆加入經高壓滅菌消毒過的黃心土5 kg，再經過甲醛嚴格熏蒸殺菌。為期兩個月的生長后進行菌株接種試驗。利用實驗組前期通過試驗獲得的5株菌種，按照相同濃度配置100 mL菌液一次性施澆于幼苗體，進行5個重復的處理，設置無菌培養液為空白對照[2]。于15 d后進行低磷脅迫試驗處理。

1.3.1 菌液制備 5株供試菌株：無柄盤菌屬Peziculasp.(NG1)，毛霉屬Mucorsp.(CG5)，擬青霉屬Paecilomycessp.(AJ6)，絲葚霉屬Papulosporasp.(AJ14)，青霉屬Penicilliumsp.(AJ13)。其中，菌株AJ6以國家發明專利的方式保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，專利信息：一株能促進杉木磷吸收的內生真菌，保藏編號：No.9186。

設置相同水平的100 mL菌液：將供試菌株轉接于50 mL液體培養基中，然后通過恒溫振蕩培養箱連續培養3 d。將菌液以無菌生理鹽水按照十倍稀釋法進行稀釋，通過在顯微鏡下觀察血球計數板計算并配制成5.5×106cfu/mL的濃度。將配置好的菌液從植物頂端施澆，確保其根、莖、葉及土壤中均有菌液，試驗設置無菌液體培養基作為空白對照組。

1.3.2 低磷脅迫設計 通過施氮肥、鉀肥及其他微量元素確保變量唯一，低磷脅迫采用KH2PO4。如表1所示，本試驗設計了正常條件48 mg/kg、輕度脅迫24 mg/kg、中度脅迫12 mg/kg、重度脅迫0 mg/kg 4個磷處理水平，對照組澆水，每個水平5個重復[3]。在脅迫15、30、45、60 d時進行取樣測定各項指標：葉片酸性磷酸酶活性、植株磷含量、根系酸性磷酸酶、根際土壤酸性磷酸酶、非根際土壤酸性磷酸酶。

表1 磷脅迫試驗設計Table 1 Experimental design of phosphorus stress

實驗所用土壤為黃心壤，其基質為pH 4.50、有機質含量20.5612 mg/g、全氮含量0.3054 mg/g、水解氮0.1205 mg/g、全磷含量0.4105 mg/g、有效磷含量0.0051 mg/g、全鉀含量12.5012 mg/g、速效鉀含量0.0245 mg/g。

1.3.3 酸性磷酸酶活性測定 葉片酸性磷酸酶活性測定參考林啟美等[22]的方法。鮮葉用蒸餾水洗凈吸干后，準確稱取0.05 g立即放入含5 mL(pH 5.0)0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和5 mL 5 mmol/L對硝基苯磷酸二鈉的具塞試管中，蓋上玻璃塞，恒溫培養箱30 ℃下暗處保持30 min。隨之加入1 mL 1 mol/L NaOH終止反應，在波長為405 nm下進行比色。葉片酸性磷酸酶活性的單位為μg·g-1·h-1。

根系酸性磷酸酶活性測定參考陳永亮等[23](2006)的方法。鮮樣洗凈并吸干后，隨機稱取數條較細根并稱取0.1 g，然后加0.2 mol/L的醋酸鈉醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)5 mL。后進行冰浴勻漿。勻漿置于離心管中并在冰箱中放置1 h，然后10 000 r/min離心30 min。取1 mL上清液進行反應。

土壤酸性磷酸酶活性測定參考張海偉等[24](2010)的方法。稱取0.3 g新鮮土樣(<2 mm)于10 mL離心管中，加入4 mL 1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)，再加入2 mL 15 mmol/L的對硝基苯磷酸二鈉。在37 ℃水浴中保溫1 h后立即加入1 mL 1 mol/L NaOH終止反應，過濾后于405 nm下進行比色。土壤酸性磷酸酶活性用單位時間內每克土壤所含的酸性磷酸酶水解底物所生成的對硝基苯酚的微摩爾數來表示。

1.3.4 植株磷含量測定 參考中華人民共和國林業行業標準《森林土壤分析方法》[25]，采用H2SO4-HClO4消煮，鉬銻抗比色法測定植株磷含量，每個樣品做3個重復。

1.4 數據處理分析

數據的整理工作由Excel2010完成，數據的分析工作由SPSS19.0完成，相關圖像處理由Origin9.0完成。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase Activity，以下簡稱APA)是土壤和植物體中普遍存在的一種非常重要的水解酶，其活性高低與植物體和土壤中的磷素豐缺狀況有著密切的聯系[26]。植物以改善自身的生理性狀增強對磷的吸收量來應對低磷脅迫，如植物體內分泌酸性磷酸酶活化難溶性無機磷和有機磷。

2.1.1 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗葉片酸性磷酸酶活性的影響 由表2所示，正常條件下，各處理杉木幼苗的葉片APA活性在整個過程中均呈先上升后下降的變化趨勢，其中，菌株CG5作用下的葉片APA活性在整個脅迫期間均比對照組高。輕度脅迫條件下，各處理杉木幼苗的葉片APA活性總體呈上升的變化趨勢，且CG5菌株作用下的APA活性均比對照組高。中度脅迫條件下，不同處理均呈現先上升后下降的總體趨勢，只有菌株AJ13呈一直上升的變化趨勢；在葉片APA活性上，接菌植株在脅迫15 d時均比對照高，在脅迫至30 d時只有菌株NG1作用下的幼苗葉片APA活性比對照高，脅迫至45 d時接種菌株幼苗葉片APA活性均比對照低，脅迫至60 d時菌株AJ13和CG5作用下的幼苗葉片APA活性比對照高。重度脅迫條件下，AJ13菌株作用下的葉片APA活性在整個脅迫期間呈先上升后下降再上升的變化趨勢，其余處理均為先上升后下降的變化動態；其中，菌株NG1作用下的葉片APA活性在整個脅迫動態均比對照活性強度高。

表2 低磷脅迫下接種各菌株對杉木幼苗葉片APA活性的影響Table 2 Effects of different endophytic fungi on leaf APA activity under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

綜上所述，通過葉片APA活性的動態測定，在低磷脅迫條件下，不同杉木內生真菌接入的前期，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14以及AJ13開始發揮解磷效力，杉木幼苗葉片APA活性在內生真菌作用下顯著增加，與對照相比增加值最高可達190.27%。在脅迫中后期，APA活性與對照相比顯著降低。其中，菌株CG5在正常條件和輕度脅迫條件下能顯著提高宿主葉片APA活性，菌株NG1則在重度脅迫條件下對葉片APA活性的促進效果較顯著，能促進杉木幼苗在低磷條件下的適應性。

2.1.2 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗根系酸性磷酸酶活性的影響 由表3可以看出，對照組隨著脅迫梯度加重，根系APA活性不斷下降；接種AJ13的變化趨勢和對照組一致，但在正常條件下比對照組活性強度高27.3%。接種菌株NG1幼苗的根系APA活性呈先下降后上升的變化趨勢，在重度脅迫條件下比對照組活性強度高215.55%；其中中度和重度脅迫處理之間差異顯著(P<0.05)。接種菌株CG5幼苗的根系APA活性成先上升后下降的變化趨勢，在輕度、中度、重度脅迫條件下分別比對照高61.11%、183.41%和136.42%，各處理之間差異不顯著(P>0.05)。接種菌株AJ6幼苗的根系APA活性的變化趨勢則是上下波動，各處理之間差異不顯著(P>0.05)，各處理分別比對照組活性強度高11.39%、18.06%、111.94%、140.03%。而接種菌株AJ14幼苗的根系APA活性表現出先下降后上升的變化趨勢，各處理分別比對照組活性強度高8.35%、15.20%、121.50%、233.21%；輕度和重度脅迫處理之間異顯著(P<0.05)。綜上所述，從不同脅迫處理梯度的角度出發，菌株AJ14在重度脅迫條件下對促進根系APA活性作用最大，菌株CG5在中度和輕度脅迫條件下作用最大，菌株AJ13在正常條件下的促進作用最大。

表3 低磷脅迫下各菌株對杉木幼苗根系酸性磷酸酶活性的影響Table 3 Effects of different endophytic fungi on root APA activity on under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling (mg·h-1·g-1)

2.2 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗土壤酸性磷酸酶活性的影響

由圖1和表4可知，非根際土壤APA活性的比較：菌株NG1、AJ6、AJ14作用下的土壤APA活性在不同脅迫梯度下變化不明顯，菌株CG5作用下的土壤APA活性在重度脅迫下有略微的上升變化，而菌株AJ13作用下的土壤APA活性呈先上升后下降的變化趨勢。根際土壤APA活性的比較：隨著脅迫程度的加重，菌株NG1作用下的APA活性呈下降的變化趨勢，菌株CG5和AJ6作用下的活性表現出上下波動的變化趨勢，菌株AJ14作用下的活性無明顯變化，菌株AJ13作用下的活性有小幅度下降的變化，對照則呈微弱的上升變化趨勢。總體而言，接種內生真菌幼苗的根際土壤APA活性和非根際土壤APA活性基本上都比相應對照組的活性強度高，而根際土壤APA活性在多數情況下比非根際土壤APA活性要高。

不同小寫字母表示同一脅迫梯度條件下不同菌種間差異顯著( P<0.05)，不同大寫字母表示同一菌種作用下不同脅迫梯度間有顯著差異( P<0.05) Different small letters meant that the difference is significant between the different endophytic fungi under the same stress condition at the 0.05 level, different capital letters indicate that the difference is significant between the different stress condition with the same endophytic fungi at the 0.05 level圖1 低磷脅迫下各菌株對杉木幼苗土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig.1 Ratio of rhizosphere to non-rhizosphere on soil APA activity under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

表4 低磷脅迫下杉木幼苗土壤APA活性根際與非根際的比值Table 4 Ratio of rhizosphere to non-rhizosphere on soil APA activity under low P in Cunninghamia lanceolata seedling

2.3 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗植株磷含量的影響

從表5可以看出，接種菌株幼苗的磷含量普遍比對照組高，只有重度脅迫條件下的NG1菌株作用下的地上部分和地下部分以及輕度脅迫條件下CG5菌株作用下的地下部分比對照組低。不同脅迫梯度下，植株地上部分的含磷量都比地下部分高。正常條件下，植株地上部分的磷含量由高到低為NG1、AJ13、AJ6、CG5、AJ14、CK；植株地下部分的磷含量由高到低為AJ6、CG5、AJ13、AJ14、NG1、CK。輕度脅迫條件下，植株地上部分的磷含量由高到低為AJ13、AJ6、NG1、AJ14、CG5、CK；植株地下部分的磷含量由高到低為AJ14、AJ6、NG1、AJ13、CK、CG5。中度脅迫條件下，植株地上部分的磷含量由高到低為NG1、CG5、AJ14、AJ13、AJ6、CK；植株地下部分的磷含量由高到低為NG1、AJ14、AJ13、CG5、AJ6、CK。重度脅迫條件下，植株地上部分的磷含量由高到低為AJ14、AJ6、CG5、AJ13、CK、NG1；植株地下部分的磷含量由高到低為AJ6、AJ14、CG5、AJ13、CK、NG1。綜上所述，從整體上看，正常條件下，菌株AJ6、AJ13、NG1對植株整體含磷量的促進效果明顯，地上部分和地下部分的磷含量分別比對照高115.12%和59.47%、122.28%和51.08%、128.18%和22.14%。輕度脅迫條件下，菌株AJ6、AJ14能有效提高植株磷含量，分別比對照高68.01%和32.31%、56.28%和35.16%。中度脅迫條件下，菌株NG1對植株磷含量的促進效果顯著，且地上部分和地下部分的含磷量分別比對照高109.41%和177.64%；但在重度脅迫條件下沒有促進效果，含磷量均比對照低。重度脅迫條件下，菌株AJ6效果最顯著，地上部分和地下部分的磷含量分別比對照高51.91%和46.80%。

表5 低磷脅迫下不同內生真菌對杉木幼苗植株磷含量的影響Table 5 Effects of different endophytic fungi on the P content of plant under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

3 討論與結論

葉片酸性磷酸酶活性在不同脅迫梯度不同菌株處理下基本呈先上升的總體趨勢，這和梁霞[27-28]、張海偉[24]等的研究結果一致。從不同接種內生真菌的角度得出，菌株CG5在正常條件和輕度脅迫條件下能顯著提高宿主葉片APA活性，菌株NG1則在重度脅迫條件下對葉片APA活性的促進效果較顯著，能促進杉木幼苗在低磷條件下的適應性。CK隨著脅迫水平的增加，根系酸性磷酸酶活性逐漸降低。接種不同內生真菌幼苗根系APA活性呈不同的變化趨勢，且不同菌株在不同梯度的表現各異。菌株AJ14在重度脅迫條件下對促進根系APA活性作用最大，菌株CG5在中度和輕度脅迫條件下作用最大，菌株AJ13在正常條件下的促進作用最大。土壤酸性磷酸酶活性：接種內生真菌幼苗的根際土壤APA活性和非根際土壤APA活性基本上都比相應對照組的活性強度高。而根際土壤APA活性在多數情況下比非根際土壤APA活性要高。

通過對植株地上部分和地下部分的含磷量的測定來分析。鐘安良等[29-30]通過施用不同比例的氮磷鉀肥研究其對杉木苗期生長發育的影響，高氮缺磷或磷不足以及單施氮肥均不利于生長，磷肥有助于植物對氮肥的吸收。土壤中磷含量的多少對植物的生長起到十分重要的作用。菌株AJ6對植株磷含量的促進作用效果顯著，尤其是在正常條件、輕度脅迫和重度脅迫條件下，且對植株地上部分磷含量的影響大于地下部分；菌株NG1在中度脅迫條件下能有效提高植株地上部分和地下部分含磷量。酸性磷酸酶活性及根系分泌酸性磷酸酶活性增加能否作為評價磷效率的生理生化指標一直是近年來學者研究的熱點，但至今尚未達成觀點上的統一。

在菌液的配制上，本研究僅探索了單一菌株對杉木幼苗的影響，希望今后有機會開展混合菌對杉木生長發育的影響。在脅迫梯度上，本研究僅設置了4個脅迫梯度，還存在一定的局限性，無法更好更全面地體現杉木對磷脅迫完整的響應機制。對于整個試驗設計來說，由于時間的限制，僅研究了內生真菌-杉木共生體的各種特性，對各種響應機制的深層次原因無從涉及。對植株有顯著促進作用的菌株，后續可開展對其次生代謝物質以及分子水平等相關領域的研究。