黨參外源污染真菌的組成及其產毒特性

陳旭玉，趙祥升，劉小敏，楊美華,2*

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，海南 海口 570311；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193)

【研究意義】中藥材在種植、采收、加工和貯藏的過程中容易受到外源真菌的污染，特別是在貯藏條件不當的條件下容易引發霉變，霉變后的藥材容易產生真菌毒素，影響中藥材質量及藥品的安全[1]。其中危害最大的真菌毒素有黃曲霉毒素(Aflatoxin)，赭曲霉毒素(Ochratoxin A)，伏馬毒素(Fumonisins)等。曲霉屬是污染中藥材的主要優勢菌群之一，曲霉屬真菌產生的真菌毒素能引發肝毒性、腎毒性等重大毒性反應，嚴重威脅了消費者生命健康。【前人研究進展】黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益氣補中，生津養血的作用，為常用的補氣中藥，用于脾肺虛弱，氣短心悸，虛喘咳嗽等[2]。另外，黨參還具有鎮靜解熱、降血壓、降血糖、保肝、抗疲勞和抗腫瘤等作用[3]。黨參屬于根類藥材，易受真菌毒素污染。王文麗[4]年從黨參表面分離到刺孢曲霉A.aculeatus并檢測到赭曲霉毒素A (OTA),蘇春燕等[5]研究黨參的真菌總數高于三七和柴胡，且曲霉數高于青霉數。因此，黨參外源真菌污染不可忽視。【本研究切入點】黨參的外源真菌主要有哪些組成，除了報道的黨參有赭曲霉毒素A的污染外，是否存在其他毒素的污染，以此為切入點進行研究。【擬解決的關鍵問題】本研究通過分析云南、河北、江西、重慶、廣西、甘肅地區黨參外源真菌，初步明確外源污染菌的種類及主要的產毒真菌，為防治黨參外源污染真菌的防控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

分別從廣西、江西、云南、甘肅、河北、重慶的藥材市場購買黨參。分裝入無菌塑料袋內，帶回實驗室，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所資源中心朱平主任鑒定為黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.。

1.2 方法

1.2.1 藥材表面真菌分離 稱取10 g 黨參，加入90 mL 無菌水和20顆玻璃珠的三角瓶中，置于恒溫搖床中130 r/min室溫震蕩20 min，靜置5 min，取上清液為10-1菌懸液，依次稀釋成不同濃度，取0.5 mL均勻涂布至直徑為90 cm的含有氯霉素的麥芽提取物瓊脂Malt Extract Agar (MEA)培養皿中，放置25 ℃恒溫培養箱中培養7 d(n=5)，計算菌落數，體視鏡單孢分離進行純化[6]。

1.2.2 菌株鑒定 將純化的菌株在MEA培養基上培養7 d(25 ℃)。用無菌接種針從真菌菌落邊緣處挑取一小塊產孢結構，放置在載玻片上，加棉蘭染液，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察形態。隨后根據形態學鑒定的初步結果，提取真菌DNA，青霉屬和曲霉屬真菌采用通用引物β-tublin，其他絲狀真菌采用通用引物ITS1和ITS4進行PCR序列擴增，ITS反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃延伸7 min。β-tublin反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。所獲得的PCR產物由廣州艾基生物技術有限公司進行序列測定，測定的序列通過NCBI Blast軟件與GenBank核酸數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相關序列進行同源性比較。

1.2.3 產毒真菌菌株檢測 將待測樣品活化后，挑取少量菌絲于MEA液體培養基中，置于恒溫搖床中，培養7 d (25 ℃，120 r/min)。加入甲醇 (甲醇與樣品量的比為2∶1)，渦旋5 min，靜置20 min，取100 μl上清液置于離心管中，加入700 μl樣品稀釋液混合均勻，此為待測液。吸取100 μl待測液滴加到金標微孔中，然后用滴管吹打金標微孔中的溶液，直至孔內紅色物質完全溶解,指示結果與說明書比對，陽性樣品采用UPLC-MS/MS確認。將培養7 d (25 ℃，120 r/min)的菌液，通過多功能凈化柱處理，然后通過0.2 μl的濾紙過濾，然后上液相。UPLC-MS/MS條件：色譜柱：BEH C18(100 mm × 2.1 mm i.d., 1.7 μm, Waters Corp.)，柱溫：35 ℃；流動相：2 mM乙酸銨水溶液 (A)-甲醇 (B，含-0.1 %甲酸)，梯度洗脫：0 min: 25 % A; 2 min: 45 % A; 10 min: 90 % A; 12 min: 90 % A; 12.1 min: 25 %，流速0.3 mL/min，進樣量2 μl。質譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI), 正離子模式，多反應離子監測 (Multiple reaction monitoring，MRM)掃描，毛細管電壓2.5 Kv；離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度350 ℃，目標物的質譜條件見表1[7]。

表1 黃曲霉毒素質譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions for aflatoxin detection

2 結果與分析

2.1 黨參外源污染真菌的分離

由表2顯示，從廣西、江西、云南、甘肅、河北、重慶的6個不同地區的黨參表面共分離得到79株外源真菌，其中曲霉屬Aspergillus34株，青霉屬Penicillium30株、鏈孢霉屬Neurospora10株，擬青霉屬Paecilomyces4株，說明青霉屬和曲霉屬為黨參的外源優勢種群。

表2 6個地區黨參外源真菌的分離和鑒定Table 2 Isolation and identification of exogenous fungi from C. pilosula in six regions

黨參外源分離的曲霉屬有塔賓曲霉A.tubingensis17株，煙曲霉A.fumigatus11株，黃曲霉A.flavus4株，棘孢曲霉A.aculeatus1株，黑曲霉A.niger1株，橘青霉P.citrinum21株和草酸青霉P.oxalicum9株。曲霉屬中主要是以塔賓曲霉和煙曲霉為主，青霉主要是以橘青霉為主。

根據不同地區來源分析，廣西黨參共分離了28株，以橘青霉P.citrinum為優勢菌，云南黨參共分離了11株，以煙曲霉A.fumigatus為優勢菌；河北黨參共分離18株，以草酸青霉P.oxalicum為優勢菌；江西黨參共分離9株，以鏈孢霉菌Neurosporasp.為優勢菌；重慶和甘肅黨參分別分離5和8株，以塔賓曲霉A.tubingensis為優勢菌；說明不同地區黨參的表面污染真菌數量及種類存在差異。

2.2 黃曲霉毒素的產毒種類確定

檢測到的陽性樣品再次通過UPLC-MS/MS檢測，圖1-A為黃曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG2和AFG2標準品(26 ng/mL), 圖1-B為黃曲霉GXDC1-5產生AFB1；圖1-C黃曲霉 HBDC1-5產生AFB1和AFB2；圖1-D黃曲霉YNDC1-5產生AFB1、AFB2和AFG2。不同的黃曲霉種產生的毒素種類不一樣。

2.3 黃曲霉毒素含量的測定

真菌在液體培養基培養7 d后，其菌液凈化后檢測，其中黃曲霉GXDC1-5產生AFB1，濃度為11.91 ng/mL；黃曲霉HBDC1-5中產生AFB1和AFB2，濃度分別為9.28和1.53 ng/mL；黃曲霉YNDC1-5產生AFB1、AFB2和AFG2，濃度分別為76.09、2.36和1.49 ng/mL (表3)，說明不同的真菌產生毒素類型及能力有差別。

表3 不同黃曲霉產生毒素的結果Table 3 The results of the production of toxins by A. flavus

A: 黃曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG1 和 AFG2標準濃度的色譜圖；B, C和D: 分別為黃曲霉GXDC1-5，HBDC1-5 和 YNDC1-5產生黃曲霉毒素的色譜圖A: Chromatogram of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 standard concentration；B, C and D: Chromatogram of AFTs produce by A. flavus GXDC1-5，HBDC1-5 and YNDC1-5,respectively圖1 黃曲霉毒素標準品和黃曲霉產生毒素的色譜圖Fig.1 Chromatogram of AFTs standard concentration and the AFTs produce by A. flavus

3 討 論

真菌在自然界中分布廣泛，在中藥材中造成污染的情況非常普遍，不同地區因生態條件差異，所銷售的不同種類藥材受到污染性真菌的類群也有所不同。蔡飛對5個地區的甘草進行分離鑒定發現曲霉和青霉是霉變甘草的主要污染菌[6]。宋美芳等[8]研究昆明和玉溪地區絞股藍發現其主要污染菌為曲霉屬真菌。宋美芳等[9]報道三七污染真菌以淡紫擬青霉和橘青霉為優勢菌；草果污染菌以淡紫擬青霉和黃曲霉為優勢菌, 腎茶上的淡紫擬青霉和茄病鐮刀菌隨貯藏期的延長而增加，并有黃曲霉出現。陳娟[10]對藥材市場上霉變甘草的污染真菌分析發現青霉(P.polonicum和P.crustosum)和曲霉(A.parasiticus)為優勢真菌。陳娟[11]等對7種根類藥材(甘草，巴戟天，黃芩，白術，三七，當歸)污染真菌的分析發現青霉屬真菌為主要污染真菌。本文分析黨參外源污染真菌主要是青霉Penicillium和曲霉Aspergillus。可見中藥材的外源污染物主要以青霉和曲霉為主。

本研究從黨參中分離得到的真菌有：塔賓曲霉A.tubingensis，煙曲霉A.fumigatus，黃曲霉A.flavus，棘孢曲霉A.aculeatus，黑曲霉A.niger，橘青霉P.citrinum，草酸青霉P.oxalicum，鏈孢霉菌Neurospora等,其中云南地區、重慶地區和甘肅地區黨參的外源污染真菌以曲霉屬Aspergillus為優勢菌，河北地區和廣西地區黨參外源真菌以青霉屬Penicillium為優勢菌，江西黨參的外源真菌以鏈格孢為主，說明不同地區其外源真菌的種類及數量有差異。P.citrinum能夠產生橘青霉素[12]，但在分離的橘青霉中沒有檢測到。黃曲霉毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉產生[13-14]，本研究共分離出4株黃曲霉，有3株產生毒素，說明黃曲霉中產生黃曲霉毒素的概率很大。

大量研究表明中藥材中AFTS、OTA、FB、ZEA等真菌毒素的污染率較高，有的存在多種毒素污染的情況[15]。王文麗[4]年從黨參表面分離到刺孢曲霉A.aculeatus并檢測到赭曲霉毒素A (OTA)，本文從黨參表面分離了3株黃曲霉，檢測到黃曲霉毒素。黨參中是否存在其他毒素有待下一步的研究。