帶葉兜蘭菌根真菌的鑒定及其促生作用

王曉國，閆海霞，李秀玲，何荊洲，周主貴*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農業科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】蘭科菌根(OM)是蘭科植物原球莖或成年植株根部與特定真菌形成的共生體，在自然界中，幾乎所有的蘭科植物均具有菌根，其生長和繁殖過程全部或部分依靠菌根提供養分[1]。1929年，Catoni從蘭科植物中分離到真菌并在培養基上誘導形成子實體，從而極大推動了OM真菌的研究[2]。1992年，Currah建立已發現的OM真菌15屬29種2個腐生類群的基本檢索表，為OM真菌的分類研究提供了可靠依據和有效手段[3]。已有研究表明，大多數OM真菌已得到分離和鑒定，結合現有文獻已確定OM真菌有5個類群300余種，隨著檢測技術和分離方法的改進，更多的OM真菌還將會被發現和報道[4]。兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個類群，主要分布于東南亞、南洋群島及太平洋西南大洋洲島嶼國家[5]，因其野生種受到過度采集和自然生境受到嚴重破壞[6]，分布區和種群數量已急劇減少[7]，其全屬植物已被列入“野生動植物瀕危物種國際貿易公約”(CITES)附錄Ⅰ而受到嚴格保護[8]。兜蘭在我國主要分布于西南地區和華南部分地區[9-10]，廣西西北部是野生帶葉兜蘭(PaphiopedilumhirsutissimumLindl.ex Hook)的主要分布區域，近年來廣西的野生帶葉兜蘭分布破碎化現象加劇，種群恢復工作刻不容緩。菌根真菌的篩選和應用可提高帶葉兜蘭繁育的成功率，但帶葉兜蘭的菌根真菌種類多而雜，而迄今關于其OM真菌促生作用的研究較少。因此，鑒定帶葉兜蘭根段分離獲得的OM真菌并分析其促生作用，對帶葉兜蘭種群恢復和其他種類野生兜蘭的保育具有重要意義。【前人研究進展】與蘭科植物形成菌根的真菌多為擔子菌門的蠟殼菌(Sebacinaceae)、角擔菌(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌(Tulasnellaceae)和革菌(Thelephoraceae)等專一性較強的真菌[11]，也有一些報道認為銹病菌(Pucciniomycotina)和鐮刀菌(Fusarium)等真菌可與蘭科植物形成菌根[12-13]。此外，OM真菌的群落結構受到多種因素影響，如有些OM真菌存在于干燥的環境，而其他真菌僅在非本地的種植園內存在[14]。不同類型蘭科植物的OM真菌群落也不盡相同，侯天文等[15]研究發現，同一生境27屬73種附生蘭和地生蘭的OM真菌群落中只有10種同時存在于附生蘭和地生蘭中。真菌隨著植物生長季節和營養需求變化呈相似的變化規律，不同生長時期的植物需要OM真菌種類不盡相同，其中需求峰值出現在生長期而果期對OM真菌的需求大幅下降[15]。此外，對種子萌發具有促進作用的OM真菌不一定有利于種子萌發后植株生長[15-16]，一些植物在種子萌發時需要的OM真菌多樣性較成年后的需要更多[17]，而一些在種子萌發時需要更多特異性的OM真菌[18]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對蘭科植物的研究主要集中在其菌根真菌的群落組成與環境因子的關系及種子萌發方面，鮮見關于促生真菌篩選研究的報道?！緮M解決的關鍵問題】對所收集的野生帶葉兜蘭根段組織分離獲得的OM真菌進行形態觀察和ITS序列分析鑒定，并分析部分真菌的促生作用，以期篩選出可用于兜蘭保育的有效OM真菌，為帶葉兜蘭種群恢復和自然回歸及其他種類野生兜蘭的保育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生帶葉兜蘭根段樣品于2017年9月采自廣西樂業縣，收集后裝于自封袋，適量填充原生境苔蘚或腐殖質后帶回實驗室置于4 ℃短期保存。帶葉兜蘭組培苗帶瓶煉苗10 d后移至滅菌基質中煉苗3 d，用于開展促生菌株篩選試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 OM真菌分離 采用常規組織分離法分離OM真菌[13]。對帶葉兜蘭根段進行鏡檢，選取具有菌絲團的根段，在流水下沖洗干凈，用75 %酒精浸泡8 min進行表面消毒后，無菌水沖洗2次，將其浸泡于10 %次氯酸鈉中充分搖動消毒8 min，再用無菌水沖洗8次后置于無菌濾紙上吸干表面水分，將根段切成1～2 mm小段后，用滅菌鑷子撕開根皮將外皮層轉移并貼在PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1000 mL)上，每皿放置2個根段皮層。取最后1次表面消毒的無菌水洗滌液涂布于PDA平板上檢測有無雜菌污染。在25 ℃恒溫培養箱培養7 d待菌落長出后，采用尖端菌絲法進行菌落分離純化，經反復純化直至得到純化菌落。將純化的菌株分別轉移至斜面培養基保存備用。

1.2.2 OM真菌鑒定 結合形態學和分子生物學鑒定方法對帶葉兜蘭菌根真菌進行鑒定。在培養過程中，觀察菌株的生長速度、菌落大小、質地和邊緣等形態特征及其孢子、產孢結構和菌絲體等顯微結構特征，對照相關資料及《真菌鑒定手冊》初步確定菌根真菌的分類學地位。同時將純化后的菌根真菌菌株接種至PDA固體培養基上25 ℃恒溫培養。待菌絲長滿培養基后，用刀片刮取菌絲，加液氮研磨成粉末后，采用CTAB基因組DNA法提取菌絲基因組DNA。ITS區段的PCR擴增采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系30.0 μl：2×TaqPCR MasterMix 15.0 μl，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μl，模版DNA 1.0 μl，ddH2O 13.0 μl。擴增程序：95 ℃預變性4 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序結果進行校對后，通過GenBank的Blast進行在線同源性比對，結合形態學鑒定結果明確帶葉兜蘭菌根的分類地位。

1.2.3 促生作用試驗 將準備篩選的菌株接種到液體PDA培養基中，100 r/min、25 ℃培養10 d。培養好的菌液離心后收集菌絲并用無菌水清洗，再用無菌水稀釋10倍澆灌。為確保接種成功，在種植帶葉兜蘭組培苗出瓶苗時用無菌水稀釋的菌液蘸根，然后在接種15和30 d時再各澆灌1次，每次每株澆灌5 mL，對照組只澆灌無菌水。隨機將接種后的帶葉兜蘭幼苗擺放在試驗大棚中，溫度控制在25 ℃左右，相對濕度為65 %～80 %，光照12 h/d。每個處理3次重復，每個重復30株苗，期間澆水保持基質濕潤。

1.2.4 測定項目及指標 將初步篩選具有一定促生作用的10株菌株接種至帶葉兜蘭幼苗90 d后，清洗植株上的泥土并用吸水紙吸干植株表面水分，統計葉片數和根數，使用游標卡尺測量葉長和根長，使用分析天平秤量鮮重。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 16.0進行差異顯著性分析，以Graphpad 8.0制圖。

2 結果與分析

2.1 OM真菌的形態觀察及初步判定

OM的主要特征是在根皮細胞內形成特殊的菌絲團結構。帶葉兜蘭的大多數OM真菌分布在根的外皮層細胞中，多為致密或疏松的菌絲團，少數細胞內有菌絲團消解形成的針狀結晶(圖1)。顯微鏡檢測結果表明，用于組織分離的153個根段中有143個根段內有OM真菌共生形成的菌絲團結構，占總根段數的93.75 %。

A：根段中的菌絲團；B：針狀結晶；C：致密型菌絲團；D：疏松型菌絲團A：Hyphae in root；B：Needle-shaped crystal；C：Loose pelotons；D：Dense pelotons圖1 帶葉兜蘭菌根的顯微結構(20×)Fig.1 Microstructure of nutrition root seedling of P. hirsutissimun(20×)

用鑷子撕開根皮，將外皮層貼在培養基上進行OM真菌分離培養，共分離出OM真菌134株。依據菌落形態、有無孢子產生和菌絲結構等進行初步判斷。其中，菌落白色、淡黃色或淡紅色，分生孢子呈長橢圓狀或鐮刀狀的菌株判定為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌，共42株；菌落黑灰色、有同心輪紋，氣生菌絲少、子座球形的為炭球菌屬(Daldinia)真菌，共20株；菌落乳白色，氣生菌絲較多，菌絲成念珠狀或菌絲直角分支的菌株判定為膠膜屬(Tulasnella)真菌，共20株；不產孢或孢子形態不明確的未知菌根真菌30株(圖2)。此外，仍有22株菌株通過基本形態只能判定到科水平。因此，依據形態特征可將大部分菌株進行分類學初步判定，而小部分菌株的顯微結構極相似，依據形態學鑒定很難確定其歸屬，但其菌落形態存在明顯差異，可進一步進行ITS序列比對分析以判定其分類地位。

2.2 OM真菌的鑒定和種類組成

對獲得的OM真菌rDNA ITS序列進行比對，序列相同的判定為同一種，序列相似度在98 %以上、菌落形態和菌絲結構相似的判定為另一種，共得到82個序列，歸為82種。將上述序列分別與GenBank中公布親緣關系相近的菌種進行Blast在線比對，確定菌株的分類學地位。結果(表1)顯示，鑒定的82種菌株可歸為8屬，隸屬于2門5綱5目。其中5屬歸于子囊菌門(Ascomycota)，其余3屬歸于擔子菌門(Basidiomycota)；在綱分類水平上，糞殼菌綱 (Sordariomycetes)為優勢菌群，占總菌株數的31.3 %；在屬水平上以鐮刀菌屬(Fusarium)、炭球菌屬(Daldinia)和膠膜菌屬(Tulasnella)為優勢屬，分別占總菌株數的31.3 %、14.9 %和14.9 %。

表1 帶葉兜蘭OM真菌的類群組成Table 1 The composition of orchid mycorrhizal fungi in roots of P. hirsutissimun

2.3 促生作用分析

將分離得到的134株菌株接種至帶葉兜蘭幼苗(組培苗)進行促生菌株初步篩選，結果有10株菌株表現出一定的促生作用，分別為A-8(鐮刀菌屬)、C-3(炭團菌屬)、B-2(膠膜菌屬)、G-6(炭皮菌屬)、A-4(鐮刀菌屬)、A-6(膠膜菌屬)、H-3(膠膜菌屬)、H-2(膠膜菌屬)、A-1(鐮刀菌屬)和A-11(鐮刀菌屬)。采用蘸根法結合澆灌法將這10株菌株接種至帶葉兜蘭組培苗培養90 d后，僅有4株菌株(A-6、A-8、B-2和C-3)對帶葉兜蘭組培苗的生長指標具有顯著(P<0.05，下同)或極顯著(P<0.01，下同)促生作用，其余菌株的促生效果不顯著(P>0.05)(圖3)。其中，膠膜菌屬菌株A-6對帶葉兜蘭幼苗鮮重、葉長、葉數、根長和根數的促生作用均極顯著大于CK(分別增大148.20 %、54.15 %、46.18 %、81.25 %和49.03 %)；其次為鐮刀菌屬A-8，對帶葉兜蘭幼苗鮮重、葉長和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大54.18 %、60.38 %和33.65 %)；膠膜菌屬B-2對帶葉兜蘭鮮重、根數和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大65.53 %、33.41 %和47.81 %)；其后為炭團菌屬C-3，對帶葉兜蘭組培苗鮮重和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大36.05 %和45.93 %)，對葉長的促生作用顯著大于CK (18.11 %)?？梢姡珹-6對帶葉兜蘭組培苗各生長指標的促進效果最好，A-8對帶葉兜蘭組培苗鮮重和葉長等的促進效果較明顯，B-2對帶葉兜蘭組培苗鮮重、根長和根數等的促進效果較佳。說明不同屬菌根真菌菌株對帶葉兜蘭組培苗的促生作用不同，預示不同屬OM真菌對帶葉兜蘭植株的促生機制或促生能力存在差異，要實現利用內生菌促進帶葉兜蘭植株特定組織生長，必須先有針對性地篩選促進該組織生長的特定菌株。

A-1：炭球菌菌落(C-3)；B-1：炭團菌菌落(G-6)；C-1：膠膜菌菌落(A-4)；D-1：膠膜菌菌落(H-2)；E-1：膠膜菌菌落(A-6)；F-1：膠膜菌菌落.(B-2)；G-1：鐮刀菌菌落(A-8)；H-1：膠膜菌菌落(H-3)；A-2：炭球菌菌絲(C-3)；B-2：炭團菌菌絲(G-6)；C-2：膠膜菌菌絲(A-4)；D-2：膠膜菌菌絲.(H-2)；E-2：膠膜菌菌絲(A-6)；F-2：膠膜菌菌絲.(B-2)；G-2：鐮刀菌孢子(A-8)；H-2：膠膜菌菌絲(H-3)A-1：Colony morphology of Daldinia sp.(C-3)；B-1：Colony morphology of Hypoxylon sp.(G-6) ；C-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(A-4)；D-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(H-2)；E-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(A-6)；F-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(B-2)；G-1：Colony morphology of Fusarium sp.(A-8)；H-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(H-3)；A-2：Mycelium morphology of Daldinia sp.(C-3)；B-2：Mycelium morphology of Hypoxylon sp.(G-6) ；C-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(A-4)；D-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(H-2)；E-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(A-6)；F-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(B-2)；G-2：Mycelium morphology of Fusarium sp.(A-8)；H-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(H-3)圖2 部分帶葉兜蘭菌根真菌的菌落和菌絲形態Fig.2 The colony and mycelium morphology of some mycorrhizal fungi from P. hirsutissimun

各小圖中圖柱上*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)* on the bar represented significant difference(P< 0.05)，** represented extremely significant difference(P<0.01)圖3 接種不同菌根真菌菌株對帶葉兜蘭幼苗生長指標的影響Fig.3 Effect of incoulation with different mycorihizal fungi strains on the seedling growth of P. hirsutissimun

2.4 菌根真菌rDNA ITS序列的系統發育分析

通過序列對比，選擇32株有代表性菌株的rDNA ITS序列與下載的相似性最高的序列進行多序列比對，采用非加權組平均法(UPGMA)，通過Tajima-Nei模塊構建聚類樹狀圖(圖4)，處于同一分支的菌株親緣關系較近，可以判定為同一屬；ITS區進化速度較快，在真菌的屬、種間存在明顯的豐富變異，可用其進行屬及以下水平鑒定。

圖4 基于rDNA ITS基因序列的部分菌根真菌的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi isolated from P. hirsutissimun

3 討 論

蘭科植物在種子萌發或原球莖發育期對營養的需求完全依靠真菌，隨著植株的生長，成年蘭科植物植株具有光合作用能力后對OM真菌的依賴逐漸減弱，根中真菌定殖也呈減少趨勢[19]。一些附生蘭和地生蘭對生長環境要求極為苛刻，其根系主要起固定植株作用，對養分的吸收能力不強，仍需依靠OM真菌提供的氮、磷和水分維持生長[20]。帶葉兜蘭多見于地生或石上浮生，為半附生種類，本研究中的153個根段均采自石上附生的帶葉兜蘭，其中有93.75 %根段檢測到菌根真菌共生形成的菌絲團結構，說明帶葉兜蘭成年植株由于生長環境的緣故對OM真菌的依賴程度仍較高。

已有研究表明，蘭科植物與特定類群OM真菌發生的共生關系并不隨著地理區域的變化而變化[19]，但是蘭科植物除能與專一的真菌類群形成菌根外，還能與某些真菌類群形成菌根[21]。膠膜菌屬為蘭科植物專一性較強的真菌，均能與杓蘭屬和兜蘭屬的多數蘭科植物形成OM真菌[5-9]；杏黃兜蘭和硬葉兜蘭菌根中分離到真菌類群的鐮刀菌為優勢菌群[22-23]；Rasmussen[4]也將鐮刀菌屬歸為OM真菌。本研究從帶葉兜蘭根段中分離到134株OM真菌，歸屬于82種8屬，其中鐮刀菌屬、碳球菌屬和膠膜菌屬為優勢菌屬，表明本研究分離到的鐮刀菌屬真菌為帶葉兜蘭的OM真菌。

不同生長階段帶葉兜蘭植株體內的OM真菌種類和組成通常存在明顯差異，從成年植株上分離到的OM真菌不一定能促進種子萌發，能促進種子萌發的真菌也不一定具有促生作用[24]。有些真菌即使能形成共生菌根，也不具有促進種子萌發或促進植株生長的作用[25]。本研究中，僅有少數菌根真菌對帶葉兜蘭組培苗具有顯著促生作用，其中膠膜菌屬真菌A-6對帶葉兜蘭組培苗的促生作用最大，其余膠膜菌屬真菌均無顯著促生作用，而無顯著促生作用的膠膜菌屬真菌是否在一些極端環境條件下產生保護植株或促進種子萌發的作用，有待進一步探究。此外，鐮刀菌屬真菌A-8也可促進帶葉兜蘭植株生長，與陳娟等[26]研究認為鐮刀菌可促進杏黃兜蘭生長、Jiang等[27]研究認為鐮刀菌對黃花白芨也有促生作用的觀點一致，說明鐮刀菌對蘭科植物的促生作用較普遍；炭團菌屬C-3對帶葉兜蘭生長也具有促進作用，然而目前鮮見此類真菌可促進其他蘭科植物生長的研究報道，因此，其形成菌根后仍需進行再分離以確定其為OM真菌或能分解木質纖維以利于帶葉兜蘭生長。

4 結 論

帶葉兜蘭根段多數定殖有OM真菌，其中的鐮刀菌屬、炭團菌屬和膠膜菌屬為優勢菌屬。膠膜菌屬菌株A-6對帶葉兜蘭組培苗的促生效果最佳，鐮刀菌屬菌株A-8次之，膠膜菌屬菌株B-2和炭團菌屬菌株C-3的促生效果也較明顯，這些菌株可作為保育和人工栽培帶葉兜蘭的菌種資源儲備。