藏豬和大約克豬CKM基因多態性及表達差異分析

鞏興龍，段夢琪，張 健，李雨晴，張芳芳，趙 雪，強巴央宗，商 鵬*

(1. 西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝 860000；2. 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉畜牧水產中心，黑龍江 大慶 163000)

【研究意義】動物產肉性能與肉品質一直以來都是廣大育種工作者關注的熱點，從分子水平研究豬肌肉組織生長發育調控機制將為育種工作提供新的突破口。肌酸激酶(CK)作為唯一的磷酸原激酶，是參與Cr+MgATP2-+ H+←→ PCr+MgADP-反應的關鍵酶[1-3]，主要為肌肉收縮及運動提供能量[4-6]。它有4 種同功酶形式，包括肌型 (MM-CK)、腦型 (BB-CK)、雜化型 (MB-CK) 和線粒體型 (Mi-CK/MtCK)[7]。其中CK肌型肌酸激酶(CKM)是一種組織特異性酶，存在于各種肌肉細胞中，參與細胞內的能量轉運、肌肉收縮以及三磷酸腺苷的再生[8]。【前人研究進展】研究發現，CKM基因敲除小鼠的肌肉組織的ATP合成能力明顯增強[9]。CKM基因主要在骨骼肌和心肌中高表達[10-11]，集中在M線附近[12]，在腦、肺和一些癌細胞中低表達[13]，而骨骼肌的發育與動物的產肉能力以及生長發育具有重要關聯。有報道發現CKM基因在藏豬胚胎期背最長肌高表達，提出該基因與藏豬的慢生長和形態呈負相關[14]，意味CKM基因的高表達在藏豬中能抑制骨骼肌的生長發育以及降低藏豬的產肉能力。【本研究的切入點】本試驗主要探究CKM基因在藏豬和大約克豬的多態性以及在不同組織的表達水平。【擬解決的關鍵問題】為進一步了解CKM基因在豬體內的調控機制奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選擇西藏自治區林芝地區(海拔約2900 m)飼養的藏豬和大約克豬為研究對象。藏豬(TP)來源于西藏農牧學院藏豬養殖基地，大約克豬(YY)來源于林芝宇高生態農業開發有限公司養殖基地。共采集120 份耳組織(藏豬60 頭，大約克豬60 頭)，用于基因組DNA提取。選擇6 月齡大小的藏豬和大約克豬(各8 頭)進行屠宰，分別采集肝臟、背最長肌及背脂組織各2 份，立即放入RNA保存液，液氮速凍，-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.2 DNA、RNA以及cDNA的制備與提取

采用苯酚氯仿抽提法從耳組織中提取基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop2000分光光度計檢測DNA濃度和質量，RNase-Free ddH2O溶解，-20 ℃保存。

利用RNA提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，CW0584S)提取試驗豬背最長肌、背脂和肝臟組織的總RNA。用Nano Drop2000分光光度計檢測RNA濃度和質量，-80 ℃保存。

cDNA制備根據一步法cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)進行反轉錄。合成體系見表1。

表1 cDNA第一鏈合成反應體系(20 μl)Table 1 System of cDNA first strand synthesis reaction

反應程序：溫和吹打混勻，42 ℃延伸30 min，85 ℃保溫5 min終止反應；cDNA保存在-20 ℃備用。

1.3 DNA引物設計與合成

從NCBI網站中下載CKM基因(登錄號：NC_010448.4 )起始密碼子上游約3 kb區域DNA序列。使用 Premier 5.0軟件設計CKM基因的特異性引物，由上海生物工程有限公司合成，TE溶解，4 ℃保存。引物序列見表2。

表2 CKM基因 5’側翼區引物序列Table 2 Primer sequence of CKM gene 5 'lateral region

1.4 定量PCR引物設計與合成

1.4.1 熒光定量PCR引物設計與合成 從NCBI網站中下載已知豬的CKM基因的mRNA序列，使用Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR擴增引物，以β-actin基因為內參基因，引物由上海生物工程有限公司進行設計合成，TE進行溶解，4 ℃保存，引物序列見表3。

表3 定量PCR引物序列 Table 3 Primer sequences for quantitative analysis

1.4.2 熒光定量結果計算方法 熒光定量PCR每個樣品設置3 個重復，每個體系20 μl，含有1.0 μl cDNA，10.0 μl mix(Transgen)、7.8 μl ddH2O、正向和反向引物各0.6 μl(10.0 nmol/μl)。采用2-ΔΔCT方法計算CKM基因的mRNA水平。

ΔCT(樣品)=CT(樣品目的基因)-CT(樣品內參基因)

ΔCT(標準樣)=CT(標準樣目的基因)-CT(標準樣內參基因)

ΔΔCT=ΔCT(樣品)-ΔCT(標準樣)

目的基因表達量=2-ΔΔCT

1.5 轉錄因子預測

從GeneBank下載CKM基因具有顯著突變位點的引物序列，利用在線軟件CONSITE (http://jaspar.binf.ku.dk/)，選擇脊椎動物，閾值設置80，把下載的突變前后的引物序列分別復制到軟件上，SCAN來預測SNPs位點突變前后轉錄因子結合位點的變化。

1.6 統計分析

對個體測序測得數據結果，使用Chormas Pro軟件對測序峰圖進行分析，使用Excel軟件計算各突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗分析基因型分布和基因型頻率的差異。對熒光定量結果，使用Excel進行初步整理，使用SigmaPlot 10.0制備圖表，數據以“平均數±標準誤”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

DNA提取結果顯示所提取的樣品DNA條帶比較清晰，無拖尾現象和其它雜帶的出現，未有蛋白質的污染，說明提取的DNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿下一步實驗需求，檢測結果見圖1。

圖1 豬基因組DNA凝膠電泳結果圖Fig.1 Pig genomic DNA gel electrophoresis results

2.2 RNA提取結果

所提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，組織總RNA的28 S、18 S兩條帶比較清晰，無拖尾現象和其它雜帶的出現，也未有蛋白質和DNA雜質的污染，說明各組提取的總RNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿足后續反轉錄和熒光定量的需要，檢測結果見圖2。

圖2 組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Tissue total RNA agarose gel electrophoresis

2.3 SNP篩選與基因分型

藏豬、大約克豬混池測序結果見圖3，在CKM基因起始密碼子上游3 kb區域發現2 個C/T突變，位于起始密碼子上游1185處和1324處，記為C-1185T和C-1324T。并對藏豬、大約克豬基因型頻率和基因頻率結果卡方檢驗進行基因分型，經檢驗CKM基因C-1185T和C-1324T位點均符合Hardy-Wein berg平衡(P>0.05)。基因型頻率和基因頻率及卡方檢驗結果見表4。

表4 CKM基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 4 CKM gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

圖3 CKM基因SNPs位點測序峰圖Fig.3 Sequencing chromatograms for the SNPs of CKM gene

2.4 CKM基因的mRNA表達

通過使用熒光定量PCR技術對CKM基因在藏豬和大約克豬各組織中的mRNA表達水平進行檢測，結果顯示：在3個組織中，CKM基因在藏豬背最長肌的表達量最高，其次是背脂和肝臟。其中，在背最長肌中，CKM基因藏豬表達量極顯著高于大約克豬表達量(P<0.01)；在背脂中，CKM基因大約克豬表達量顯著高于藏豬表達量(P<0.05)；在肝臟組織中，CKM基因藏豬表達量極顯著高于大約克豬表達量(P<0.01)。

2.5 轉錄因子預測

對SNPS位點進行轉錄因子功能預測發現，CKM

*代表顯著性差異(P<0.05)，**代表極顯著差異(P<0.01)* Significant difference(P<0.05), ** Extremely significant difference(P<0.01)圖4 CKM基因在TP、YY 2個品種豬背最長肌、背脂、和肝臟中mRNA的相對表達量Fig.4 Relative expression of CKM gene in longissimus dorsi,backfat and liver of TP and YY pigs

基因C-1185T位點突變前存在11 個轉錄因子，突變后存在10 個轉錄因子，其中6 個轉錄因子突變前后相同，較突變前5 個轉錄因子發生變化，新增4個轉錄因子Erg、EHF、ELK4和SPIB；C-1324T位點突變前存在6 個轉錄因子，突變后存在10 個轉錄因子，較突變前3 個轉錄因子沒有發生變化，新增7 個轉錄因子TEAD1、En1、NFKB1、REL、FOXI1、Foxd3和Foxq1。

3 討 論

CKM是哺乳動物細胞內表達的4 種肌酸激酶亞型之一 ，定位在6號染色體上，是肌肉發育和分化的標志[15]，是骨骼肌能量代謝的關鍵酶之一，是細胞生長信號途徑中的重要成分。本研究在CKM基因起始密碼子上游3000 bp區域中發現突變位點C-1185T和C-1324T，該單核苷酸多態性位點的基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在極顯著差異(P<0.01)。通過對這兩個突變位點進行轉錄因子功能預測，發現新增的轉錄因子大多與細胞生長發育、分化和代謝以及肢體發育密切相關，如轉錄因子Erg、EHF和En1，轉錄因子Erg對于胚胎發育，細胞增殖、分化以及細胞凋亡機制的調控均有重要作用[16]，轉錄因子EHF廣發存在于細胞核內，參與細胞增殖、分化、凋亡、衰老等過程[17]，轉錄因子En1與神經系統的發育有關，并在組織肌肉中持續表達[18]。揭示了這兩個多態性位點可能與肌肉的生長發育相關。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌、背脂和肝臟進行實時熒光定量檢測，發現CKM基因在背最長肌中的表達最高，且CKM基因在背最長肌的表達水平顯著高于背脂和肝臟組織。由此分析CKM基因在背最長肌中發揮重要作用。CKM基因在藏豬背最長肌中的表達水平極顯著高于大約克豬(P<0.01)，推測CKM基因在藏豬背最長肌中的高表達可能會抑制藏豬的肌肉發育及體型生長。這與商鵬研究發現CKM基因在豬胚胎發育期間肌肉組織的相對表達量在藏豬里面最高，烏金豬次之，大約克豬的表達量最低[14]結果相吻合。在本研究中，CKM基因在藏豬肝臟組織的mRNA表達水平顯著高于大約克豬(P<0.01)，肝臟調控機體代謝功能，基于CKM基因在細胞能量代謝中發揮重要作用，充分說明藏豬較大約克豬抗逆性強的特點[19]。CKM基因在藏豬和大約克豬的背脂表達水平存在顯著差異(P<0.05)，推測可能與瘦肉型和脂肪型豬種有關。藏豬屬于脂肪性豬種，CKM基因的低表達促進藏豬脂肪沉積，大約克豬屬于瘦肉型豬種，CKM基因在大約克豬背脂的高表達會抑制其脂肪沉積。具體分子調控機制還需要進一步討論。

4 結 論

綜上所述，本研究通過對CKM基因起始密碼子上游3 kb區域進行SNPs挑選，發現了單核苷酸多態性位點C-1185T和C-1324T，且該位點符合哈迪-溫伯格定律(P>0.05)。實時熒光定量PCR結果顯示，CKM基因在藏豬和大約克豬存在顯著差異表達，尤其CKM基因在藏豬背最長肌中的mRNA表達量極顯著高于大約克豬(P<0.01)。CKM基因在不同品種3個組織的表達水平說明CKM基因與骨骼肌的生長發育呈負相關。本研究通過對CKM基因多態性及表達模式的分析，為進一步研究CKM基因對于豬的生長發育以及產肉能力提供理論依據，為藏豬種質資源保護提供參考。